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El músculo esquelético es un tejido heterogéneo compuesto predominantemente por miofibrillas, que en humanos se clasifican típicamente en tres tipos: una “lenta” (tipo 1) y dos “rápidas” (tipos 2A y 2X). Sin embargo, la heterogeneidad entre y dentro de los tipos tradicionales de miofibrillas sigue siendo poco comprendida. Aplicamos enfoques transcriptómicos y proteómicos a 1050 y 1038 miofibrillas individuales del vasto lateral humano, respectivamente. El estudio proteómico incluyó hombres, y el estudio transcriptómico incluyó 10 hombres y 2 mujeres. Además de las isoformas de la cadena pesada de miosina, identificamos proteínas metabólicas, proteínas ribosómicas y proteínas de unión celular como fuentes de variabilidad intermiofibrilar multidimensional. Además, a pesar de la identificación de grupos de fibras lentas y rápidas, nuestros datos sugieren que las fibras de tipo 2X son fenotípicamente indistinguibles de otras fibras de contracción rápida. Además, la clasificación basada en la cadena pesada de miosina es insuficiente para describir el fenotipo de las miofibras en las miopatías nemalínicas. En general, nuestros datos sugieren una heterogeneidad multidimensional de las miofibras, con fuentes de variación que van más allá de las isoformas de la cadena pesada de miosina.
La heterogeneidad celular es una característica inherente de todos los sistemas biológicos, que permite a las células especializarse para satisfacer las diferentes necesidades de los tejidos y las células.1 La visión tradicional de la heterogeneidad de las fibras del músculo esquelético ha sido que las neuronas motoras definen el tipo de fibra dentro de una unidad motora, y que el tipo de fibra (es decir, tipo 1, tipo 2A y tipo 2X en humanos) está determinado por las características de las isoformas de la cadena pesada de miosina (MYH).2 Esto se basó inicialmente en su inestabilidad de pH ATPasa,3,4 y posteriormente en su expresión molecular de MYH.5 Sin embargo, con la identificación y posterior aceptación de fibras "mixtas" que coexpresan múltiples MYH en proporciones variables, las fibras del músculo esquelético se consideran cada vez más como un continuo en lugar de como tipos de fibra distintos.6 A pesar de esto, el campo todavía depende en gran medida de MYH como clasificador principal para la clasificación de miofibras, una visión probablemente influenciada por las limitaciones y los sesgos significativos de los primeros estudios en roedores cuyos perfiles de expresión de MYH y rango de tipos de fibra difieren de los de los humanos. humanos.2 La situación se complica aún más por el hecho de que los diferentes músculos esqueléticos humanos exhiben una amplia gama de tipos de fibras.7 El vasto lateral es un músculo mixto con un perfil de expresión de MYH intermedio (y por lo tanto representativo).7 Además, su facilidad de muestreo lo convierte en el músculo mejor estudiado en humanos.
Por lo tanto, la investigación imparcial de la diversidad de las fibras musculares esqueléticas mediante potentes herramientas ómicas es fundamental, pero también compleja, en parte debido a la naturaleza multinucleada de dichas fibras. Sin embargo, las tecnologías de transcriptómica8,9 y proteómica10 han experimentado una revolución en sensibilidad en los últimos años gracias a diversos avances tecnológicos, lo que permite el análisis del músculo esquelético con resolución de fibra individual. Como resultado, se ha logrado un progreso significativo en la caracterización de la diversidad de fibras individuales y su respuesta a estímulos atróficos y al envejecimiento11,12,13,14,15,16,17,18. Es importante destacar que estos avances tecnológicos tienen aplicaciones clínicas, permitiendo una caracterización más detallada y precisa de la desregulación asociada a enfermedades. Por ejemplo, la fisiopatología de la miopatía nemalínica, una de las enfermedades musculares hereditarias más comunes (MIM 605355 y MIM 161800), es compleja y confusa.19,20 Por lo tanto, una mejor caracterización de la desregulación de las fibras del músculo esquelético podría conducir a avances significativos en nuestra comprensión de esta enfermedad.
Desarrollamos métodos para el análisis transcriptómico y proteómico de fibras musculares esqueléticas individuales aisladas manualmente de muestras de biopsia humana y los aplicamos a miles de fibras, lo que nos permitió investigar la heterogeneidad celular de las fibras musculares esqueléticas humanas. En el transcurso de este trabajo, demostramos el potencial del fenotipado transcriptómico y proteómico de las fibras musculares e identificamos proteínas metabólicas, ribosomales y de unión celular como fuentes significativas de variabilidad interfibra. Además, utilizando este flujo de trabajo proteómico, caracterizamos la relevancia clínica de la miopatía por nematodos en fibras musculares esqueléticas individuales, revelando un cambio coordinado hacia fibras no oxidativas, independientemente del tipo de fibra según la MYH.
Para investigar la heterogeneidad de las fibras musculares esqueléticas humanas, desarrollamos dos flujos de trabajo para permitir el análisis del transcriptoma y el proteoma de fibras musculares esqueléticas individuales (Figura 1A y Figura suplementaria 1A). Desarrollamos y optimizamos varios pasos metodológicos, desde el almacenamiento de la muestra y la preservación de la integridad del ARN y las proteínas hasta la optimización del rendimiento para cada enfoque. Para el análisis del transcriptoma, esto se logró insertando códigos de barras moleculares específicos de la muestra en el paso inicial de la transcripción inversa, lo que permitió agrupar 96 fibras para un procesamiento posterior eficiente. La secuenciación más profunda (±1 millón de lecturas por fibra) en comparación con los enfoques tradicionales de célula única enriqueció aún más los datos del transcriptoma. 21 Para la proteómica, utilizamos un gradiente cromatográfico corto (21 minutos) combinado con la adquisición de datos DIA-PASEF en un espectrómetro de masas timsTOF para optimizar la profundidad del proteoma manteniendo un alto rendimiento. 22,23 Para investigar la heterogeneidad de las fibras musculares esqueléticas sanas, caracterizamos los transcriptomas de 1050 fibras individuales de 14 donantes adultos sanos y los proteomas de 1038 fibras de 5 donantes adultos sanos (Tabla suplementaria 1). En este artículo, estos conjuntos de datos se denominan transcriptomas y proteomas de 1000 fibras, respectivamente. Nuestro enfoque detectó un total de 27 237 transcritos y 2983 proteínas en los análisis transcriptómicos y proteómicos de 1000 fibras (Figura 1A, Conjuntos de datos suplementarios 1-2). Después de filtrar los conjuntos de datos transcriptómicos y proteómicos para >1000 genes detectados y 50 % de valores válidos por fibra, se realizaron análisis bioinformáticos posteriores para 925 y 974 fibras en el transcriptoma y el proteoma, respectivamente. Después del filtrado, se detectaron un promedio de 4257 ± 1557 genes y 2015 ± 234 proteínas (media ± DE) por fibra, con variabilidad interindividual limitada (Figuras suplementarias 1B–C, Conjuntos de datos suplementarios 3–4). Sin embargo, la variabilidad intrasujeto fue más pronunciada entre los participantes, probablemente debido a diferencias en el rendimiento de ARN/proteína entre fibras de diferentes longitudes y áreas de sección transversal. Para la mayoría de las proteínas (>2000), el coeficiente de variación fue inferior al 20% (Figura suplementaria 1D). Ambos métodos permitieron capturar un amplio rango dinámico de transcritos y proteínas con firmas altamente expresadas importantes para la contracción muscular (p. ej., ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Figuras suplementarias 1E–F). La mayoría de las características identificadas eran comunes entre los conjuntos de datos transcriptómicos y proteómicos (Figura suplementaria 1G), y las intensidades medias de UMI/LFQ de estas características estaban razonablemente bien correlacionadas (r = 0,52) (Figura suplementaria 1H).
Flujo de trabajo de transcriptómica y proteómica (creado con BioRender.com). BD Curvas de rango dinámico para MYH7, MYH2 y MYH1, y umbrales calculados para la asignación del tipo de fibra. E, F Distribución de la expresión de MYH en las fibras en los conjuntos de datos de transcriptómica y proteómica. G, H Gráficos de aproximación y proyección de diversidad uniforme (UMAP) para transcriptómica y proteómica coloreados por tipo de fibra basado en MYH. I, J Gráficos de características que muestran la expresión de MYH7, MYH2 y MYH1 en los conjuntos de datos de transcriptómica y proteómica.
Inicialmente, nos propusimos asignar el tipo de fibra basado en MYH a cada fibra utilizando un enfoque optimizado que aprovecha la alta sensibilidad y el rango dinámico de la expresión de MYH en conjuntos de datos ómicos. Estudios previos han utilizado umbrales arbitrarios para etiquetar las fibras como tipo 1 puro, tipo 2A, tipo 2X o mixtos basándose en un porcentaje fijo de expresión de diferentes MYH11,14,24. Nosotros utilizamos un enfoque diferente en el que la expresión de cada fibra se clasificó según los MYH que utilizamos para tipificar las fibras: MYH7, MYH2 y MYH1, correspondientes a las fibras de tipo 1, tipo 2A y tipo 2X, respectivamente. Luego calculamos matemáticamente el punto de inflexión inferior de cada curva resultante y lo utilizamos como umbral para asignar las fibras como positivas (por encima del umbral) o negativas (por debajo del umbral) para cada MYH (Figura 1B–D). Estos datos demuestran que MYH7 (Figura 1B) y MYH2 (Figura 1C) tienen perfiles de expresión de activación/desactivación más distintivos a nivel de ARN en comparación con el nivel de proteína. De hecho, a nivel de proteína, muy pocas fibras no expresaron MYH7, y ninguna fibra tuvo una expresión de MYH2 del 100%. A continuación, utilizamos umbrales de expresión predeterminados para asignar tipos de fibra basados en MYH a todas las fibras en cada conjunto de datos. Por ejemplo, las fibras MYH7+/MYH2-/MYH1- se asignaron al tipo 1, mientras que las fibras MYH7-/MYH2+/MYH1+ se asignaron al tipo mixto 2A/2X (véase la Tabla Suplementaria 2 para una descripción completa). Al agrupar todas las fibras, observamos una distribución notablemente similar de los tipos de fibras basadas en MYH tanto a nivel de ARN (Figura 1E) como de proteína (Figura 1F), mientras que la composición relativa de los tipos de fibras basadas en MYH varió entre individuos, como era de esperar (Figura suplementaria 2A). La mayoría de las fibras se clasificaron como tipo 1 puro (34-35%) o tipo 2A (36-38%), aunque también se detectó un número significativo de fibras mixtas tipo 2A/2X (16-19%). Una diferencia notable es que las fibras de tipo 2X puro solo pudieron detectarse a nivel de ARN, pero no a nivel de proteína, lo que sugiere que la expresión rápida de MYH está regulada, al menos parcialmente, postranscripcionalmente.
Validamos nuestro método de tipificación de fibras MYH basado en proteómica mediante hibridación por puntos con anticuerpos, y ambos métodos lograron una concordancia del 100 % en la identificación de fibras puras de tipo 1 y tipo 2A (véase la Figura Suplementaria 2B). Sin embargo, el método basado en proteómica resultó más sensible y eficiente para identificar fibras mixtas y cuantificar la proporción de cada gen MYH en cada fibra. Estos datos demuestran la eficacia de utilizar un método ómico objetivo y altamente sensible para caracterizar los tipos de fibras musculares esqueléticas.
Luego, utilizamos la información combinada proporcionada por la transcriptómica y la proteómica para clasificar objetivamente las miofibras basándonos en su transcriptoma o proteoma completo. Utilizando el método de aproximación y proyección de variedad uniforme (UMAP) para reducir la dimensionalidad a seis componentes principales (Figuras suplementarias 3A-B), pudimos visualizar la variabilidad de las miofibras en el transcriptoma (Figura 1G) y el proteoma (Figura 1H). Cabe destacar que las miofibras no se agruparon por participantes (Figuras suplementarias 3C-D) ni por días de prueba (Figura suplementaria 3E) en ninguno de los conjuntos de datos de transcriptómica o proteómica, lo que sugiere que la variabilidad intrasujeto en las fibras del músculo esquelético es mayor que la variabilidad intersujeto. En el gráfico UMAP, surgieron dos grupos distintos que representan miofibras "rápidas" y "lentas" (Figuras 1G-H). Las miofibras MYH7+ (lentas) se agruparon en el polo positivo de UMAP1, mientras que las miofibras MYH2+ y MYH1+ (rápidas) se agruparon en el polo negativo de UMAP1 (Figuras 1I–J). Sin embargo, no se hizo distinción entre los tipos de fibras de contracción rápida (es decir, tipo 2A, tipo 2X o mixtas 2A/2X) en función de la expresión de MYH, lo que sugiere que la expresión de MYH1 (Figura 1I–J) u otros marcadores clásicos de miofibras 2X como ACTN3 o MYLK2 (Figuras suplementarias 4A–B) no diferencia entre los distintos tipos de miofibras al considerar el transcriptoma o proteoma completo. Además, en comparación con MYH2 y MYH7, pocos transcritos o proteínas se correlacionaron positivamente con MYH1 (Figuras suplementarias 4C–H), lo que sugiere que la abundancia de MYH1 no refleja completamente el transcriptoma/proteoma de la miofibra. Se obtuvieron conclusiones similares al evaluar la expresión mixta de las tres isoformas de MYH a nivel de UMAP (Figuras complementarias 4I–J). Por lo tanto, si bien las fibras 2X pueden identificarse a nivel de transcripción basándose únicamente en la cuantificación de MYH, las fibras MYH1+ no se distinguen de otras fibras rápidas al considerar el transcriptoma o proteoma completo.
Como exploración inicial de la heterogeneidad de las fibras lentas más allá de MYH, evaluamos cuatro proteínas específicas de tipo de fibra lenta ya establecidas: TPM3, TNNT1, MYL3 y ATP2A22. Los subtipos de fibras lentas mostraron correlaciones de Pearson altas, aunque no perfectas, con MYH7 tanto en transcriptómica (Figura suplementaria 5A) como en proteómica (Figura suplementaria 5B). Aproximadamente el 25 % y el 33 % de las fibras lentas no fueron clasificadas como fibras lentas puras por todos los subtipos de genes/proteínas en transcriptómica (Figura suplementaria 5C) y proteómica (Figura suplementaria 5D), respectivamente. Por lo tanto, la clasificación de las fibras lentas basada en múltiples subtipos de genes/proteínas introduce una complejidad adicional, incluso para proteínas que se sabe que son específicas de tipo de fibra. Esto sugiere que la clasificación de las fibras basada en isoformas de una sola familia de genes/proteínas puede no reflejar adecuadamente la verdadera heterogeneidad de las fibras del músculo esquelético.
Para explorar más a fondo la variabilidad fenotípica de las fibras musculares esqueléticas humanas a la escala del modelo ómico completo, realizamos una reducción de dimensionalidad imparcial de los datos utilizando el análisis de componentes principales (PCA) (Figura 2A). De forma similar a los gráficos UMAP, ni el participante ni el día de la prueba influyeron en la agrupación de fibras a nivel de PCA (Figuras suplementarias 6A-C). En ambos conjuntos de datos, el tipo de fibra basado en MYH se explicó mediante PC2, que mostró un grupo de fibras de contracción lenta tipo 1 y un segundo grupo que contenía fibras de contracción rápida tipo 2A, tipo 2X y fibras mixtas 2A/2X (Figura 2A). En ambos conjuntos de datos, estos dos grupos estaban conectados por un pequeño número de fibras mixtas tipo 1/2A. Como era de esperar, el análisis de sobrerrepresentación de los principales impulsores de PC confirmó que PC2 estaba impulsado por firmas contráctiles y metabólicas (Figura 2B y Figuras suplementarias 6D-E, Conjuntos de datos suplementarios 5-6). En general, se descubrió que el tipo de fibra basado en MYH era suficiente para explicar la variación continua a lo largo de PC2, con la excepción de las llamadas fibras 2X que estaban distribuidas por todo el transcriptoma dentro del grupo rápido.
A. Gráficos de análisis de componentes principales (PCA) de conjuntos de datos de transcriptoma y proteoma coloreados según el tipo de fibra basado en MYH. B. Análisis de enriquecimiento de impulsores de transcripción y proteína en PC2 y PC1. El análisis estadístico se realizó utilizando el paquete clusterProfiler y valores p ajustados de Benjamini-Hochberg. C, D. Gráficos de PCA coloreados según términos de ontología génica (GO) de adhesión intercelular en el transcriptoma y términos GO de costámero en el proteoma. Las flechas representan impulsores de transcripción y proteína y sus direcciones. E, F. Gráficos de características de aproximación y proyección de variedad uniforme (UMAP) de características clínicamente relevantes que muestran gradientes de expresión independientes del tipo de fibra lenta/rápida. G, H. Correlaciones entre impulsores de PC2 y PC1 en transcriptomas y proteomas.
Inesperadamente, el tipo de miofibra basado en MYH explicó solo el segundo grado más alto de variabilidad (PC2), lo que sugiere que otros factores biológicos no relacionados con el tipo de miofibra basado en MYH (PC1) juegan un papel importante en la regulación de la heterogeneidad de la fibra del músculo esquelético. El análisis de sobrerrepresentación de los principales impulsores en PC1 reveló que la variabilidad en PC1 estaba determinada principalmente por la adhesión célula-célula y el contenido de ribosomas en el transcriptoma, y los costámeros y las proteínas ribosómicas en el proteoma (Figura 2B y Figuras suplementarias 6D-E, Conjunto de datos suplementarios 7). En el músculo esquelético, los costámeros conectan el disco Z con el sarcolema y están involucrados en la transmisión de fuerza y señalización. 25 Los gráficos PCA anotados usando características de adhesión célula-célula (transcriptoma, Figura 2C) y costámero (proteoma, Figura 2D) revelaron un fuerte desplazamiento a la izquierda en PC1, lo que indica que estas características están enriquecidas en ciertas fibras.
Un análisis más detallado de la agrupación de miofibras a nivel UMAP reveló que la mayoría de las características presentaban un gradiente de expresión basado en MYH independiente del tipo de miofibra, en lugar de ser específico de un subgrupo de miofibras. Esta continuidad se observó en varios genes asociados con afecciones patológicas (Figura 2E), como CHCHD10 (enfermedad neuromuscular), SLIT3 (atrofia muscular) y CTDNEP1 (enfermedad muscular). Esta continuidad también se observó en todo el proteoma, incluyendo proteínas asociadas con trastornos neurológicos (UGDH), señalización de insulina (PHIP) y transcripción (HIST1H2AB) (Figura 2F). En conjunto, estos datos indican continuidad en la heterogeneidad de contracción lenta/rápida independiente del tipo de fibra en diferentes miofibras.
Curiosamente, los genes impulsores en PC2 mostraron una buena correlación transcriptoma-proteoma (r = 0,663) (Figura 2G), lo que sugiere que los tipos de fibras de contracción lenta y rápida, y en particular las propiedades contráctiles y metabólicas de las fibras del músculo esquelético, están regulados transcripcionalmente. Sin embargo, los genes impulsores en PC1 no mostraron correlación transcriptoma-proteoma (r = -0,027) (Figura 2H), lo que sugiere que las variaciones no relacionadas con los tipos de fibras de contracción lenta/rápida están reguladas en gran medida postranscripcionalmente. Dado que las variaciones en PC1 se explicaron principalmente por términos de ontología de genes ribosomales, y dado que los ribosomas desempeñan un papel crucial y especializado en la célula al participar activamente e influir en la traducción de proteínas,31 a continuación nos propusimos investigar esta heterogeneidad ribosomal inesperada.
Primero coloreamos el gráfico de análisis de componentes principales de proteómica según la abundancia relativa de proteínas en el término GOCC "ribosoma citoplasmático" (Figura 3A). Aunque este término está enriquecido en el lado positivo de PC1, lo que resulta en un gradiente pequeño, las proteínas ribosómicas impulsan la partición en ambas direcciones de PC1 (Figura 3A). Las proteínas ribosómicas enriquecidas en el lado negativo de PC1 incluyeron RPL18, RPS18 y RPS13 (Figura 3B), mientras que RPL31, RPL35 y RPL38 (Figura 3C) fueron los principales impulsores en el lado positivo de PC1. Curiosamente, RPL38 y RPS13 se expresaron en mayor medida en el músculo esquelético en comparación con otros tejidos (Figura suplementaria 7A). Estas firmas ribosómicas distintivas en PC1 no se observaron en el transcriptoma (Figura suplementaria 7B), lo que indica una regulación postranscripcional.
A. Gráfico de análisis de componentes principales (PCA) coloreado según los términos de ontología génica (GO) ribosómica citoplasmática en todo el proteoma. Las flechas indican la dirección de la variación mediada por proteínas en el gráfico PCA. La longitud de la línea corresponde a la puntuación del componente principal para una proteína dada. B, C. Gráficos de características PCA para RPS13 y RPL38. D. Análisis de agrupamiento jerárquico no supervisado de proteínas ribosómicas citoplasmáticas. E. Modelo estructural del ribosoma 80S (PDB: 4V6X) que resalta las proteínas ribosómicas con diferentes abundancias en las fibras del músculo esquelético. F. Proteínas ribosómicas con diferente estequiometría localizadas cerca del canal de salida del ARNm.
Los conceptos de heterogeneidad y especialización ribosomal se han propuesto previamente, donde la presencia de distintas subpoblaciones de ribosomas (heterogeneidad ribosomal) puede influir directamente en la traducción de proteínas en diferentes tejidos32 y células33 a través de la traducción selectiva de grupos específicos de transcritos de ARNm34 (especialización ribosomal). Para identificar subpoblaciones de proteínas ribosomales coexpresadas en fibras de músculo esquelético, realizamos un análisis de agrupamiento jerárquico no supervisado de proteínas ribosomales en el proteoma (Figura 3D, Conjunto de datos suplementarios 8). Como era de esperar, las proteínas ribosomales no se agruparon por tipo de fibra según MYH. Sin embargo, identificamos tres grupos distintos de proteínas ribosomales; el primer grupo (ribosomal_cluster_1) está corregulado con RPL38 y por lo tanto tiene una mayor expresión en fibras con un perfil PC1 positivo. El segundo grupo (ribosomal_cluster_2) está corregulado con RPS13 y está elevado en fibras con un perfil PC1 negativo. El tercer grupo (ribosomal_cluster_3) no muestra una expresión diferencial coordinada en las fibras del músculo esquelético y puede considerarse la proteína ribosómica "central" del músculo esquelético. Ambos grupos ribosómicos 1 y 2 contienen proteínas ribosómicas que previamente se ha demostrado que regulan la traducción alternativa (por ejemplo, RPL10A, RPL38, RPS19 y RPS25) e influyen funcionalmente en el desarrollo (por ejemplo, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 De acuerdo con los resultados del PCA, la representación heterogénea observada de estas proteínas ribosómicas en las fibras también mostró continuidad (Figura suplementaria 7C).
Para visualizar la ubicación de las proteínas ribosómicas heterogéneas dentro del ribosoma, utilizamos un modelo estructural del ribosoma humano 80S (Protein Data Bank: 4V6X) (Figura 3E). Tras aislar las proteínas ribosómicas pertenecientes a diferentes grupos ribosómicos, sus ubicaciones no estaban estrechamente alineadas, lo que sugiere que nuestro método no logró enriquecer ciertas regiones/fracciones del ribosoma. Curiosamente, sin embargo, la proporción de proteínas de la subunidad grande en el grupo 2 fue menor que en los grupos 1 y 3 (Figura suplementaria 7D). Observamos que las proteínas con estequiometría alterada en las fibras del músculo esquelético se localizaban predominantemente en la superficie del ribosoma (Figura 3E), lo que concuerda con su capacidad para interactuar con los elementos del sitio de entrada ribosómica interna (IRES) en diferentes poblaciones de ARNm, coordinando así la traducción selectiva. 40, 41 Además, muchas proteínas con estequiometría alterada en las fibras del músculo esquelético se ubicaron cerca de regiones funcionales como el túnel de salida del ARNm (Figura 3F), que regulan selectivamente la elongación traslacional y la detención de péptidos específicos. 42 En resumen, nuestros datos sugieren que la estequiometría de las proteínas ribosómicas del músculo esquelético presenta heterogeneidad, lo que resulta en diferencias entre las fibras del músculo esquelético.
A continuación, nos propusimos identificar firmas de fibras de contracción rápida y lenta y explorar los mecanismos de su regulación transcripcional. Al comparar los grupos de fibras de contracción rápida y lenta definidos por UMAP en los dos conjuntos de datos (Figuras 1G–H y 4A–B), los análisis transcriptómicos y proteómicos identificaron 1366 y 804 características diferencialmente abundantes, respectivamente (Figuras 4A–B, Conjuntos de datos suplementarios 9–12). Observamos las diferencias esperadas en firmas relacionadas con sarcómeros (p. ej., tropomiosina y troponina), acoplamiento excitación-contracción (isoformas de SERCA) y metabolismo energético (p. ej., ALDOA y CKB). Además, los transcritos y las proteínas que regulan la ubiquitinación de proteínas se expresaron diferencialmente en fibras de contracción rápida y lenta (p. ej., USP54, SH3RF2, USP28 y USP48) (Figuras 4A–B). Además, el gen de la proteína microbiana RP11-451G4.2 (DWORF), que previamente se ha demostrado que se expresa diferencialmente en los distintos tipos de fibras musculares de cordero43 y que mejora la actividad de SERCA en el músculo cardíaco44, se reguló positivamente de forma significativa en las fibras musculares esqueléticas lentas (Figura 4A). Del mismo modo, a nivel de fibra individual, se observaron diferencias significativas en firmas conocidas como las isoformas de lactato deshidrogenasa relacionadas con el metabolismo (LDHA y LDHB, Figura 4C y Figura suplementaria 8A)45,46 así como firmas específicas de tipo de fibra previamente desconocidas (como IRX3, USP54, USP28 y DPYSL3) (Figura 4C). Hubo una superposición significativa de características expresadas diferencialmente entre los conjuntos de datos transcriptómicos y proteómicos (Figura suplementaria 8B), así como una correlación de cambio de pliegue impulsada principalmente por la expresión diferencial más pronunciada de las características del sarcómero (Figura suplementaria 8C). Cabe destacar que algunas firmas (por ejemplo, USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) mostraron una fuerte regulación postranscripcional solo a nivel proteómico y tuvieron perfiles de expresión específicos del tipo de fibra de contracción lenta/rápida (Figura suplementaria 8C).
A y B gráficos de volcán que comparan los clústeres lentos y rápidos identificados por los gráficos de aproximación y proyección de variedad uniforme (UMAP) en las Figuras 1G–H. Los puntos de color representan transcripciones o proteínas que son significativamente diferentes a FDR < 0,05, y los puntos más oscuros representan transcripciones o proteínas que son significativamente diferentes a cambio de logaritmo > 1. Se realizó un análisis estadístico bidireccional utilizando la prueba DESeq2 Wald con valores p ajustados de Benjamini-Hochberg (transcriptómica) o el método del modelo lineal Limma con análisis bayesiano empírico seguido del ajuste de Benjamini-Hochberg para comparaciones múltiples (proteómica). C Gráficos de firmas de genes o proteínas expresados diferencialmente seleccionados entre fibras lentas y rápidas. D Análisis de enriquecimiento de transcripciones y proteínas expresadas diferencialmente de manera significativa. Los valores superpuestos están enriquecidos en ambos conjuntos de datos, los valores del transcriptoma están enriquecidos solo en el transcriptoma, y los valores del proteoma están enriquecidos solo en el proteoma. El análisis estadístico se realizó utilizando el paquete clusterProfiler con valores p ajustados mediante el método de Benjamini-Hochberg. E. Factores de transcripción específicos del tipo de fibra identificados por SCENIC en función de las puntuaciones de especificidad del regulador derivadas de SCENIC y la expresión diferencial de ARNm entre los tipos de fibra. F. Perfilado de factores de transcripción seleccionados con expresión diferencial entre fibras lentas y rápidas.
Luego realizamos un análisis de sobrerrepresentación de genes y proteínas representados diferencialmente (Figura 4D, Conjunto de datos suplementario 13). El enriquecimiento de vías para características que diferían entre los dos conjuntos de datos reveló diferencias esperadas, tales como procesos de β-oxidación de ácidos grasos y metabolismo de cetonas (fibras lentas), contracción de miofilamentos/músculos (fibras rápidas y lentas, respectivamente) y procesos catabólicos de carbohidratos (fibras rápidas). La actividad de la proteína fosfatasa de serina/treonina también se elevó en las fibras rápidas, impulsada por características tales como las subunidades de fosfatasa reguladora y catalítica (PPP3CB, PPP1R3D y PPP1R3A), que se sabe que regulan el metabolismo del glucógeno (47) (Figuras suplementarias 8D-E). Otras vías enriquecidas en fibras rápidas incluyeron cuerpos de procesamiento (P) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) en el proteoma (Figura suplementaria 8F), potencialmente involucrados en la regulación postranscripcional (48), y actividad de factor de transcripción (SREBF1, RXRG, RORA) en el transcriptoma (Figura suplementaria 8G). Las fibras lentas fueron enriquecidas en actividad oxidorreductasa (BDH1, DCXR, TXN2) (Figura suplementaria 8H), unión a amida (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Figura suplementaria 8I), matriz extracelular (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Figura suplementaria 8J) y actividad receptor-ligando (FNDC5, SPX, NENF) (Figura suplementaria 8K).
Para comprender mejor la regulación transcripcional subyacente a las características de los tipos de fibras musculares lentas/rápidas, realizamos un análisis de enriquecimiento de factores de transcripción utilizando SCENIC49 (Conjunto de datos suplementarios 14). Muchos factores de transcripción se enriquecieron significativamente entre las fibras musculares rápidas y lentas (Figura 4E). Esto incluyó factores de transcripción como MAFA, que previamente se ha relacionado con el desarrollo de fibras musculares rápidas,50 así como varios factores de transcripción no asociados previamente con programas genéticos específicos de tipos de fibras musculares. Entre estos, PITX1, EGR1 y MYF6 fueron los factores de transcripción más enriquecidos en las fibras musculares rápidas (Figura 4E). Por el contrario, ZSCAN30 y EPAS1 (también conocido como HIF2A) fueron los factores de transcripción más enriquecidos en las fibras musculares lentas (Figura 4E). De acuerdo con esto, MAFA se expresó en niveles más altos en la región UMAP correspondiente a las fibras musculares rápidas, mientras que EPAS1 tuvo el patrón de expresión opuesto (Figura 4F).
Además de los genes codificadores de proteínas conocidos, existen numerosos biotipos de ARN no codificante que pueden estar involucrados en la regulación del desarrollo humano y las enfermedades. 51, 52 En conjuntos de datos de transcriptoma, varios ARN no codificantes exhiben especificidad de tipo de fibra (Figura 5A y Conjunto de datos suplementario 15), incluido LINC01405, que es altamente específico para fibras lentas y se informa que está disminuido en el músculo de pacientes con miopatía mitocondrial. 53 Por el contrario, RP11-255P5.3, correspondiente al gen lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, exhibe especificidad de tipo de fibra rápida. Tanto LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) como RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) muestran especificidad para el músculo esquelético (Figuras suplementarias 9A-B) y no presentan genes contráctiles conocidos en su entorno genómico de 1 Mb, lo que sugiere que desempeñan una función especializada en la regulación de los tipos de fibras, en lugar de regular los genes contráctiles vecinos. Los perfiles de expresión específicos para los tipos de fibras lentas y rápidas de LINC01405 y RP11-255P5.3, respectivamente, se confirmaron mediante RNAscope (Figuras 5B-C).
A. Los transcritos de ARN no codificante están significativamente regulados en las fibras musculares de contracción lenta y rápida. B. Imágenes representativas de RNAscope que muestran la especificidad del tipo de fibra de contracción lenta y rápida de LINC01405 y RP11-255P5.3, respectivamente. Barra de escala = 50 μm. C. Cuantificación de la expresión de ARN no codificante específica del tipo de miofibra determinada por RNAscope (n = 3 biopsias de individuos independientes, comparando fibras musculares rápidas y lentas dentro de cada individuo). El análisis estadístico se realizó utilizando una prueba t de Student de dos colas. Los diagramas de caja muestran la mediana y el primer y tercer cuartil, con bigotes que señalan los valores mínimo y máximo. D. Flujo de trabajo de identificación de proteínas microbianas de novo (creado con BioRender.com). E. La proteína microbiana LINC01405_ORF408:17441:17358 se expresa específicamente en las fibras musculares esqueléticas lentas (n=5 biopsias de participantes independientes, comparando las fibras musculares rápidas y lentas en cada participante). El análisis estadístico se realizó utilizando el método del modelo lineal de Limm combinado con un enfoque bayesiano empírico, seguido del método de Benjamini-Hochberg para comparaciones múltiples con ajuste del valor p. Los diagramas de caja muestran la mediana, el primer y el tercer cuartil, con los bigotes apuntando a los valores máximo y mínimo.
Recientemente, estudios han demostrado que muchos transcritos no codificantes putativos codifican proteínas microbianas transcritas, algunas de las cuales regulan la función muscular. 44, 55 Para identificar proteínas microbianas con especificidad potencial para el tipo de fibra, buscamos en nuestro conjunto de datos de proteoma de 1000 fibras utilizando un archivo FASTA personalizado que contenía las secuencias de transcritos no codificantes (n = 305) encontrados en el conjunto de datos de transcriptoma de 1000 fibras (Figura 5D). Identificamos 197 proteínas microbianas de 22 transcritos diferentes, 71 de los cuales estaban regulados diferencialmente entre fibras musculares esqueléticas lentas y rápidas (Figura suplementaria 9C y Conjunto de datos suplementario 16). Para LINC01405, se identificaron tres productos de proteínas microbianas, uno de los cuales mostró una especificidad de fibra lenta similar a su transcrito (Figura 5E y Figura suplementaria 9D). Por lo tanto, identificamos LINC01405 como un gen que codifica una proteína microbiana específica para fibras musculares esqueléticas lentas.
Desarrollamos un flujo de trabajo integral para la caracterización proteómica a gran escala de fibras musculares individuales e identificamos reguladores de la heterogeneidad de las fibras en estados saludables. Aplicamos este flujo de trabajo para comprender cómo las miopatías nemalínicas afectan la heterogeneidad de las fibras del músculo esquelético. Las miopatías nemalínicas son enfermedades musculares hereditarias que causan debilidad muscular y, en los niños afectados, presentan una variedad de complicaciones que incluyen dificultad respiratoria, escoliosis y movilidad limitada de las extremidades. 19,20 Típicamente, en las miopatías nemalínicas, las variantes patogénicas en genes como la actina alfa 1 (ACTA1) dan como resultado un predominio de la composición de miofibras de fibras de contracción lenta, aunque este efecto es heterogéneo. Una excepción notable es la miopatía nemalínica por troponina T1 (TNNT1), que tiene un predominio de fibras rápidas. Por lo tanto, una mejor comprensión de la heterogeneidad subyacente a la desregulación de las fibras del músculo esquelético observada en las miopatías nemalínicas puede ayudar a desentrañar la compleja relación entre estas enfermedades y el tipo de miofibra.
En comparación con los controles sanos (n=3 por grupo), las miofibras aisladas de pacientes con miopatía nemalínica con mutaciones en los genes ACTA1 y TNNT1 mostraron una marcada atrofia o distrofia de las miofibras (Figura 6A, Tabla suplementaria 3). Esto presentó importantes desafíos técnicos para el análisis proteómico debido a la cantidad limitada de material disponible. A pesar de esto, pudimos detectar 2485 proteínas en 272 miofibras esqueléticas. Después de filtrar para obtener al menos 1000 proteínas cuantificadas por fibra, 250 fibras fueron sometidas a un análisis bioinformático posterior. Después del filtrado, se cuantificó un promedio de 1573 ± 359 proteínas por fibra (Figura suplementaria 10A, Conjuntos de datos suplementarios 17-18). Cabe destacar que, a pesar de la reducción significativa en el tamaño de la fibra, la profundidad del proteoma de las muestras de pacientes con miopatía nemalínica se redujo solo modestamente. Además, el procesamiento de estos datos mediante nuestros propios archivos FASTA (que incluyen transcripciones no codificantes) nos permitió identificar cinco proteínas microbianas en las miofibras esqueléticas de pacientes con miopatía nemalínica (Conjunto de datos suplementarios 19). El rango dinámico del proteoma fue significativamente más amplio, y las proteínas totales del grupo de control se correlacionaron bien con los resultados de un análisis previo del proteoma de 1000 fibras (Figura suplementaria 10B-C).
A. Imágenes microscópicas que muestran atrofia o distrofia de fibras y el predominio de diferentes tipos de fibras según MYH en miopatías nemalínicas (NM) ACTA1 y TNNT1. Barra de escala = 100 μm. Para asegurar la reproducibilidad de la tinción en pacientes ACTA1 y TNNT1, se tiñeron tres biopsias de pacientes dos o tres veces (cuatro secciones por caso) antes de seleccionar imágenes representativas. B. Proporciones de tipos de fibras en participantes según MYH. C. Gráfico de análisis de componentes principales (PCA) de fibras musculares esqueléticas en pacientes con miopatías nemalínicas y controles. D. Fibras musculares esqueléticas de pacientes con miopatías nemalínicas y controles proyectadas en un gráfico PCA determinado a partir de las 1000 fibras analizadas en la Figura 2. Por ejemplo, gráficos de volcán que comparan las diferencias entre participantes con miopatías nemalínicas ACTA1 y TNNT1 y controles, y entre participantes con miopatías nemalínicas ACTA1 y TNNT1. Los círculos de colores indican proteínas que fueron significativamente diferentes a π < 0,05, y los puntos oscuros indican proteínas que fueron significativamente diferentes a FDR < 0,05. El análisis estadístico se realizó utilizando el método del modelo lineal de Limma y métodos bayesianos empíricos, seguido del ajuste del valor p para comparaciones múltiples utilizando el método de Benjamini-Hochberg. H. Análisis de enriquecimiento de proteínas expresadas diferencialmente de manera significativa en todo el proteoma y en fibras de tipo 1 y 2A. El análisis estadístico se realizó utilizando el paquete clusterProfiler y valores p ajustados de Benjamini-Hochberg. I, J. Gráficos de análisis de componentes principales (PCA) coloreados por términos de ontología génica (GO) de matriz extracelular y mitocondrial.
Debido a que las miopatías nemalínicas pueden influir en la proporción de tipos de miofibras que expresan MYH en el músculo esquelético,19,20 primero examinamos los tipos de miofibras que expresan MYH en pacientes con miopatías nemalínicas y controles. Determinamos el tipo de miofibra usando un método imparcial descrito previamente para el ensayo de 1000 miofibras (Figuras suplementarias 10D-E) y nuevamente no logramos identificar miofibras 2X puras (Figura 6B). Observamos un efecto heterogéneo de las miopatías nemalínicas en el tipo de miofibra, ya que dos pacientes con mutaciones ACTA1 tenían una mayor proporción de miofibras de tipo 1, mientras que dos pacientes con miopatía nemalínica TNNT1 tenían una menor proporción de miofibras de tipo 1 (Figura 6B). De hecho, la expresión de MYH2 y las isoformas de troponina rápida (TNNC2, TNNI2 y TNNT3) disminuyeron en las miopatías nemalínicas ACTA1, mientras que la expresión de MYH7 disminuyó en las miopatías nemalínicas TNNT1 (Figura suplementaria 11A). Esto es consistente con informes previos de cambio heterogéneo del tipo de miofibra en las miopatías nemalínicas.19,20 Confirmamos estos resultados mediante inmunohistoquímica y encontramos que los pacientes con miopatía nemalínica ACTA1 tenían un predominio de miofibras de tipo 1, mientras que los pacientes con miopatía nemalínica TNNT1 tenían el patrón opuesto (Figura 6A).
A nivel del proteoma de fibra única, las fibras musculares esqueléticas de pacientes con miopatía nemalínica ACTA1 y TNNT1 se agruparon con la mayoría de las fibras de control, siendo las fibras de miopatía nemalínica TNNT1 generalmente las más gravemente afectadas (Figura 6C). Esto fue particularmente evidente al trazar gráficos de análisis de componentes principales (PCA) de fibras pseudoinfladas para cada paciente, con los pacientes 2 y 3 de miopatía nemalínica TNNT1 apareciendo más distantes de las muestras de control (Figura suplementaria 11B, Conjunto de datos suplementario 20). Para comprender mejor cómo se comparan las fibras de pacientes con miopatía con las fibras sanas, utilizamos información detallada obtenida del análisis proteómico de 1000 fibras de participantes adultos sanos. Proyectamos las fibras del conjunto de datos de miopatía (pacientes con miopatía nemalínica ACTA1 y TNNT1 y controles) en el gráfico PCA obtenido del análisis proteómico de 1000 fibras (Figura 6D). La distribución de los tipos de fibras MYH a lo largo de PC2 en las fibras de control fue similar a la distribución de fibras obtenida del análisis proteómico de 1000 fibras. Sin embargo, la mayoría de las fibras en pacientes con miopatía nemalínica se desplazaron hacia abajo en PC2, solapándose con fibras de contracción rápida sanas, independientemente de su tipo de fibra MYH nativo. Por lo tanto, aunque los pacientes con miopatía nemalínica ACTA1 mostraron un desplazamiento hacia las fibras de tipo 1 cuando se cuantificaron mediante métodos basados en MYH, tanto la miopatía nemalínica ACTA1 como la miopatía nemalínica TNNT1 desplazaron el proteoma de las fibras del músculo esquelético hacia las fibras de contracción rápida.
Luego comparamos directamente cada grupo de pacientes con controles sanos e identificamos 256 y 552 proteínas expresadas diferencialmente en las miopatías nemalínicas ACTA1 y TNNT1, respectivamente (Figura 6E–G y Figura suplementaria 11C, Conjunto de datos suplementarios 21). El análisis de enriquecimiento genético reveló una disminución coordinada en las proteínas mitocondriales (Figura 6H–I, Conjunto de datos suplementarios 22). Sorprendentemente, a pesar del predominio diferencial de los tipos de fibras en las miopatías nemalínicas ACTA1 y TNNT1, esta disminución fue completamente independiente del tipo de fibra basado en MYH (Figura 6H y Figuras suplementarias 11D–I, Conjunto de datos suplementarios 23). Tres proteínas microbianas también fueron reguladas en las miopatías nemalínicas ACTA1 o TNNT1. Dos de estas microproteínas, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (también conocida como LINC00598 o Lnc-FOXO1) y ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), mostraron abundancia diferencial solo en miofibras de tipo 1. Se ha informado previamente que ENSG00000215483_TR14_ORF67 juega un papel en la regulación del ciclo celular. 56 Por otro lado, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (correspondiente a LINC01798) aumentó tanto en miofibras de tipo 1 como de tipo 2A en la miopatía ACTA1-nemalina en comparación con controles sanos (Figura suplementaria 12A, Conjunto de datos suplementarios 24). Por el contrario, las proteínas ribosómicas no se vieron afectadas en gran medida por la miopatía nemalínica, aunque la RPS17 se reguló a la baja en la miopatía nemalínica ACTA1 (Fig. 6E).
El análisis de enriquecimiento también reveló una regulación positiva de los procesos del sistema inmunitario en las miopatías nemalínicas ACTA1 y TNNT1, mientras que la adhesión celular también aumentó en la miopatía nemalínica TNNT1 (Figura 6H). El enriquecimiento de estos factores extracelulares se reflejó en las proteínas de la matriz extracelular que desplazaron el PCA en PC1 y PC2 en dirección negativa (es decir, hacia las fibras más afectadas) (Figura 6J). Ambos grupos de pacientes mostraron una mayor expresión de proteínas extracelulares involucradas en las respuestas inmunitarias y los mecanismos de reparación del sarcolema, como las anexinas (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 y su proteína interactuante S100A1159 (Figuras suplementarias 12B-C). Se ha informado previamente que este proceso está aumentado en las distrofias musculares60 pero, hasta donde sabemos, no se ha asociado previamente con las miopatías nemalínicas. El funcionamiento normal de esta maquinaria molecular es necesario para la reparación del sarcolema tras una lesión y para la fusión de los miocitos recién formados con las miofibras58,61. Por lo tanto, el aumento de la actividad de este proceso en ambos grupos de pacientes sugiere una respuesta reparadora a la lesión causada por la inestabilidad de las miofibras.
Los efectos de cada miopatía nemalínica estuvieron bien correlacionados (r = 0,736) y mostraron una superposición razonable (Figuras suplementarias 11A–B), lo que indica que las miopatías nemalínicas ACTA1 y TNNT1 tienen efectos similares en el proteoma. Sin embargo, algunas proteínas se regularon solo en las miopatías nemalínicas ACTA1 o TNNT1 (Figuras suplementarias 11A y C). La proteína profibrótica MFAP4 fue una de las proteínas más reguladas positivamente en la miopatía nemalínica TNNT1, pero permaneció sin cambios en la miopatía nemalínica ACTA1. SKIC8, un componente del complejo PAF1C responsable de regular la transcripción del gen HOX, se reguló negativamente en la miopatía nemalínica TNNT1, pero no se vio afectado en la miopatía nemalínica ACTA1 (Figura suplementaria 11A). La comparación directa de la miopatía nemalínica ACTA1 y TNNT1 reveló mayores reducciones en las proteínas mitocondriales y aumentos en las proteínas del sistema inmunitario en la miopatía nemalínica TNNT1 (Figura 6G–H y Figuras suplementarias 11C y 11H–I). Estos datos son consistentes con la mayor atrofia/distrofia observada en la miopatía nemalínica TNNT1 en comparación con la miopatía nemalínica TNNT1 (Figura 6A), lo que sugiere que la miopatía nemalínica TNNT1 representa una forma más grave de la enfermedad.
Para evaluar si los efectos observados de la miopatía nemalínica persisten a nivel de todo el músculo, realizamos un análisis proteómico global de biopsias musculares de la misma cohorte de pacientes con miopatía nemalínica TNNT1 y las comparamos con controles (n=3 por grupo) (Figura suplementaria 13A, Conjunto de datos suplementarios 25). Como era de esperar, los controles estaban estrechamente relacionados en el análisis de componentes principales, mientras que los pacientes con miopatía nemalínica TNNT1 exhibieron una mayor variabilidad entre muestras similar a la observada en el análisis de fibra única (Figura suplementaria 13B). El análisis global reprodujo las proteínas expresadas diferencialmente (Figura suplementaria 13C, Conjunto de datos suplementarios 26) y los procesos biológicos (Figura suplementaria 13D, Conjunto de datos suplementarios 27) resaltados al comparar fibras individuales, pero perdió la capacidad de distinguir entre diferentes tipos de fibras y no logró explicar los efectos heterogéneos de la enfermedad en las fibras.
En conjunto, estos datos demuestran que la proteómica de miofibras individuales puede dilucidar características biológicas clínicas que no son detectables mediante métodos específicos como la inmunoblotting. Además, estos datos resaltan las limitaciones de utilizar únicamente la tipificación de fibras de actina (MYH) para describir la adaptación fenotípica. De hecho, si bien el cambio de tipo de fibra difiere entre las miopatías nemalínicas de actina y troponina, ambas miopatías nemalínicas desacoplan la tipificación de fibras MYH del metabolismo de las fibras del músculo esquelético hacia un proteoma muscular más rápido y menos oxidativo.
La heterogeneidad celular es fundamental para que los tejidos satisfagan sus diversas demandas. En el músculo esquelético, esto se describe a menudo como tipos de fibras caracterizadas por diferentes grados de producción de fuerza y fatigabilidad. Sin embargo, es evidente que esto explica solo una pequeña parte de la variabilidad de las fibras musculares esqueléticas, que es mucho más variable, compleja y multifacética de lo que se pensaba. Los avances tecnológicos han arrojado luz sobre los factores que regulan las fibras musculares esqueléticas. De hecho, nuestros datos sugieren que las fibras de tipo 2X podrían no ser un subtipo distinto de fibra muscular esquelética. Además, identificamos proteínas metabólicas, proteínas ribosómicas y proteínas asociadas a la célula como determinantes principales de la heterogeneidad de las fibras musculares esqueléticas. Al aplicar nuestro flujo de trabajo proteómico a muestras de pacientes con miopatía por nematodos, demostramos además que la tipificación de fibras basada en MYH no refleja completamente la heterogeneidad del músculo esquelético, especialmente cuando el sistema está alterado. De hecho, independientemente del tipo de fibra basado en MYH, la miopatía por nematodos produce un cambio hacia fibras más rápidas y menos oxidativas.
Las fibras musculares esqueléticas se han clasificado desde el siglo XIX. Los análisis ómicos recientes nos han permitido comenzar a comprender los perfiles de expresión de los diferentes tipos de fibras MYH y sus respuestas a distintos estímulos. Como se describe aquí, los enfoques ómicos también presentan la ventaja de una mayor sensibilidad para cuantificar los marcadores de tipo de fibra que los métodos tradicionales basados en anticuerpos, sin depender de la cuantificación de un único marcador (o de unos pocos) para definir un tipo de fibra muscular esquelética. Utilizamos flujos de trabajo transcriptómicos y proteómicos complementarios e integramos los resultados para examinar la regulación transcripcional y postranscripcional de la heterogeneidad de las fibras en las fibras musculares esqueléticas humanas. Este flujo de trabajo no permitió identificar fibras de tipo 2X puras a nivel proteico en el vasto lateral de nuestra cohorte de hombres jóvenes sanos. Esto concuerda con estudios previos de fibras individuales que encontraron menos del 1 % de fibras 2X puras en el vasto lateral sano, aunque esto debería confirmarse en otros músculos en el futuro. La discrepancia entre la detección de fibras 2X casi puras a nivel de ARNm y solo fibras 2A/2X mixtas a nivel de proteína es desconcertante. La expresión de ARNm de la isoforma MYH no es circadiana,67 lo que sugiere que es improbable que hayamos "pasado por alto" la señal de inicio de MYH2 en fibras 2X aparentemente puras a nivel de ARN. Una posible explicación, aunque puramente hipotética, podría ser diferencias en la estabilidad de la proteína y/o el ARNm entre las isoformas MYH. De hecho, ninguna fibra rápida es 100% pura para ninguna isoforma MYH, y no está claro si los niveles de expresión de ARNm de MYH1 en el rango del 70-90% darían como resultado una abundancia igual de MYH1 y MYH2 a nivel de proteína. Sin embargo, al considerar el transcriptoma o proteoma completo, el análisis de clúster puede identificar con confianza solo dos clústeres distintos que representan fibras musculares esqueléticas lentas y rápidas, independientemente de su composición MYH precisa. Esto concuerda con los análisis que utilizan enfoques transcriptómicos de núcleo único, que generalmente identifican solo dos grupos mionucleares distintos. 68, 69, 70 Además, aunque estudios proteómicos previos han identificado fibras de tipo 2X, estas fibras no se agrupan por separado del resto de las fibras rápidas y muestran solo un pequeño número de proteínas diferencialmente abundantes en comparación con otros tipos de fibras según MYH. 14 Estos resultados sugieren que deberíamos retomar la visión de principios del siglo XX sobre la clasificación de las fibras musculares, que dividía las fibras del músculo esquelético humano no en tres clases distintas según MYH, sino en dos grupos según sus propiedades metabólicas y contráctiles. 63
Más importante aún, la heterogeneidad de las miofibras debe considerarse en múltiples dimensiones. Estudios previos de "ómicas" han apuntado en esta dirección, sugiriendo que las fibras del músculo esquelético no forman grupos discretos sino que se organizan a lo largo de un continuo. 11, 13, 14, 64, 71 Aquí, mostramos que, además de las diferencias en las propiedades contráctiles y metabólicas del músculo esquelético, las miofibras pueden diferenciarse por características relacionadas con las interacciones célula-célula y los mecanismos de traducción. De hecho, encontramos heterogeneidad de ribosomas en las fibras del músculo esquelético que contribuye a la heterogeneidad independientemente de los tipos de fibras lentas y rápidas. La causa subyacente de esta heterogeneidad sustancial de las miofibras, independientemente del tipo de fibra lenta y rápida, sigue sin estar clara, pero puede apuntar a una organización espacial especializada dentro de los fascículos musculares que responden de manera óptima a fuerzas y cargas específicas,72 comunicación celular especializada o específica de órganos con otros tipos de células en el microambiente muscular73,74,75 o diferencias en la actividad de los ribosomas dentro de las miofibras individuales. De hecho, se ha demostrado que la heteroplasmia ribosómica, ya sea mediante la sustitución paráloga de RPL3 y RPL3L o a nivel de la 2′O-metilación del ARNr, está asociada con la hipertrofia del músculo esquelético76,77. Las aplicaciones multiómicas y espaciales, combinadas con la caracterización funcional de las miofibras individuales, impulsarán aún más nuestra comprensión de la biología muscular a nivel multiómico78.
Al analizar los proteomas de miofibras individuales de pacientes con miopatías nemalínicas, también demostramos la utilidad, eficacia y aplicabilidad de la proteómica de miofibras individuales para dilucidar la fisiopatología clínica del músculo esquelético. Además, al comparar nuestro flujo de trabajo con el análisis proteómico global, pudimos demostrar que la proteómica de miofibras individuales proporciona la misma profundidad de información que la proteómica tisular global y amplía esta profundidad al tener en cuenta la heterogeneidad interfibra y el tipo de miofibra. Además de las diferencias esperadas (aunque variables) en la proporción de tipos de fibra observadas en las miopatías nemalínicas ACTA1 y TNNT1 en comparación con los controles sanos,19 también observamos remodelación oxidativa y extracelular independiente del cambio de tipo de fibra mediado por MYH. Anteriormente se ha informado de fibrosis en miopatías nemalínicas TNNT1.19 Sin embargo, nuestro análisis se basa en este hallazgo al revelar también niveles aumentados de proteínas extracelulares secretadas relacionadas con el estrés, como las anexinas, involucradas en los mecanismos de reparación del sarcolema, en miofibras de pacientes con miopatías nemalínicas ACTA1 y TNNT1.57,58,59 En conclusión, los niveles aumentados de anexina en las miofibras de pacientes con miopatía nemalínica pueden representar una respuesta celular para reparar miofibras gravemente atróficas.
Aunque este estudio representa el análisis ómico de fibras musculares completas de fibras individuales más extenso realizado hasta la fecha en humanos, no está exento de limitaciones. Aislamos fibras musculares esqueléticas de una muestra relativamente pequeña y homogénea de participantes y de un solo músculo (el vasto lateral). Por lo tanto, es imposible excluir la existencia de poblaciones de fibras específicas en distintos tipos de músculos y en extremos de la fisiología muscular. Por ejemplo, no podemos descartar la posibilidad de que un subconjunto de fibras ultrarrápidas (p. ej., fibras 2X puras) surja en velocistas y/o atletas de fuerza altamente entrenados79 o durante períodos de inactividad muscular66,80. Además, el tamaño limitado de la muestra de participantes nos impidió investigar las diferencias de sexo en la heterogeneidad de las fibras, ya que se sabe que las proporciones de los tipos de fibras difieren entre hombres y mujeres. Asimismo, no pudimos realizar análisis transcriptómicos y proteómicos en las mismas fibras musculares o muestras de los mismos participantes. A medida que nosotros y otros seguimos optimizando los análisis de células individuales y de miofibras individuales mediante análisis ómicos para lograr una cantidad ultrabaja de muestras (como se demuestra aquí en el análisis de fibras de pacientes con miopatía mitocondrial), se hace evidente la oportunidad de combinar enfoques multiómicos (y funcionales) dentro de fibras musculares individuales.
En resumen, nuestros datos identifican y explican los factores transcripcionales y postranscripcionales que influyen en la heterogeneidad del músculo esquelético. En concreto, presentamos datos que cuestionan un dogma arraigado en la fisiología del músculo esquelético, asociado a la definición clásica de los tipos de fibras basada en la mioglobina (MYH). Esperamos reavivar el debate y, en última instancia, replantear nuestra comprensión de la clasificación y la heterogeneidad de las fibras musculares esqueléticas.
Catorce participantes caucásicos (12 hombres y 2 mujeres) aceptaron voluntariamente participar en este estudio. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Universitario de Gante (BC-10237), cumplió con la Declaración de Helsinki de 2013 y se registró en ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Las características generales de los participantes se presentan en la Tabla Suplementaria 1. Tras obtener el consentimiento informado verbal y escrito, los participantes se sometieron a un examen médico antes de su inclusión definitiva en el estudio. Los participantes eran jóvenes (22-42 años), sanos (sin afecciones médicas ni antecedentes de tabaquismo) y moderadamente activos físicamente. El consumo máximo de oxígeno se determinó mediante un ergómetro de escalón para evaluar la aptitud física, como se describió anteriormente. 81
Se tomaron muestras de biopsia muscular en reposo y en ayunas tres veces, con intervalos de 14 días. Dado que estas muestras se tomaron como parte de un estudio más amplio, los participantes consumieron placebo (lactosa), un antagonista del receptor H1 (540 mg de fexofenadina) o un antagonista del receptor H2 (40 mg de famotidina) 40 minutos antes de la biopsia. Hemos demostrado previamente que estos antagonistas de los receptores de histamina no afectan la aptitud del músculo esquelético en reposo81, y no se observó agrupamiento relacionado con el estado en nuestros gráficos de control de calidad (Figuras suplementarias 3 y 6). Se mantuvo una dieta estandarizada (41,4 kcal/kg de peso corporal, 5,1 g/kg de peso corporal de carbohidratos, 1,4 g/kg de peso corporal de proteínas y 1,6 g/kg de peso corporal de grasas) durante 48 horas antes de cada día experimental, y se consumió un desayuno estandarizado (1,5 g/kg de peso corporal de carbohidratos) en la mañana del día experimental. Bajo anestesia local (0,5 ml de lidocaína al 1% sin epinefrina), se obtuvieron biopsias musculares del músculo vasto lateral mediante aspiración percutánea de Bergström.82 Las muestras musculares se incluyeron inmediatamente en RNAlater y se almacenaron a 4 °C hasta la disección manual de las fibras (hasta 3 días).
Los haces de miofibras recién aislados se transfirieron a un medio RNAlater fresco en una placa de cultivo. A continuación, las miofibras individuales se disecaron manualmente utilizando un estereomicroscopio y pinzas finas. Se disecaron veinticinco fibras de cada biopsia, prestando especial atención a la selección de fibras de diferentes áreas de la biopsia. Después de la disección, cada fibra se sumergió suavemente en 3 μl de tampón de lisis (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) que contenía enzimas proteinasa K y DNasa para eliminar las proteínas y el ADN no deseados. La lisis celular y la eliminación de proteínas/ADN se iniciaron mediante una breve agitación en vórtex, centrifugación del líquido en una microcentrífuga e incubación a temperatura ambiente (10 min). El lisado se incubó en un termociclador (T100, Bio-Rad) a 37 °C durante 5 min, a 75 °C durante 5 min, y luego se almacenó inmediatamente a -80 °C hasta su posterior procesamiento.
Se prepararon bibliotecas de ARN poliadenilado compatibles con Illumina a partir de 2 µl de lisado de miofibras utilizando el kit QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep (Lexogen). Los métodos detallados se encuentran en el manual del fabricante. El proceso comienza con la síntesis de ADNc de primera cadena mediante transcripción inversa, durante la cual se introducen identificadores moleculares únicos (UMI) y códigos de barras i1 específicos de la muestra para asegurar la agrupación de muestras y reducir la variabilidad técnica durante el procesamiento posterior. A continuación, el ADNc de 96 miofibras se agrupa y purifica con perlas magnéticas, tras lo cual se elimina el ARN y se realiza la síntesis de la segunda cadena utilizando cebadores aleatorios. La biblioteca se purifica con perlas magnéticas, se añaden etiquetas i5/i7 específicas de la agrupación y se amplifica por PCR. Un paso de purificación final produce bibliotecas compatibles con Illumina. La calidad de cada agrupación de bibliotecas se evaluó utilizando el kit High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Según la cuantificación realizada con Qubit, las muestras se agruparon en concentraciones equimolares (2 nM). La muestra resultante se secuenció en un instrumento NovaSeq 6000 en modo estándar utilizando el kit de reactivos NovaSeq S2 (1 × 100 nucleótidos) con una carga de 2 nM (4 % PhiX).
Nuestro flujo de trabajo se basa en el flujo de análisis de datos QuantSeq Pool de Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Los datos se desmultiplexaron primero con bcl2fastq2 (v2.20.0) según el índice i7/i5. La lectura 2 se desmultiplexó con idemux (v0.1.6) según el código de barras de la muestra i1 y se extrajeron las secuencias UMI con umi_tools (v1.0.1). A continuación, las lecturas se recortaron con cutadapt (v3.4) en varias rondas para eliminar las lecturas cortas (<20 de longitud) o las que consistían únicamente en secuencias adaptadoras. Finalmente, las lecturas se alinearon con el genoma humano usando STAR (v2.6.0c) y los archivos BAM se indexaron con SAMtools (v1.11). Se eliminaron las lecturas duplicadas usando umi_tools (v1.0.1). Finalmente, se realizó el conteo de alineamientos utilizando featureCounts en Subread (v2.0.3). El control de calidad se llevó a cabo utilizando FastQC (v0.11.9) en varias etapas intermedias del proceso.
Todo el procesamiento y visualización bioinformática posterior se realizó en R (v4.2.3), principalmente utilizando el flujo de trabajo Seurat (v4.4.0). 83 Por lo tanto, los valores UMI individuales y las matrices de metadatos se transformaron en objetos Seurat. Se eliminaron los genes expresados en menos del 30% de todas las fibras. Las muestras de baja calidad se eliminaron en función de un umbral mínimo de 1000 valores UMI y 1000 genes detectados. Finalmente, 925 fibras pasaron todos los pasos de filtrado de control de calidad. Los valores UMI se normalizaron utilizando el método Seurat SCTransform v2, 84 incluyendo todas las 7418 características detectadas, y las diferencias entre participantes se eliminaron mediante regresión. Todos los metadatos relevantes se pueden encontrar en el Conjunto de datos suplementario 28.
Fecha de publicación: 10 de septiembre de 2025