Efecto antibiopelícula y estimulación de la cicatrización de los apósitos de nitrato de plata.

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El crecimiento microbiano en las heridas a menudo se manifiesta como biopelículas, que interfieren con la cicatrización y son difíciles de erradicar. Los nuevos apósitos de plata afirman combatir las infecciones de heridas, pero su eficacia antibiopelícula y sus efectos de cicatrización independientes de la infección son generalmente desconocidos. Utilizando modelos de biopelícula in vitro e in vivo de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, informamos sobre la efectividad de los apósitos generadores de iones Ag1+; apósitos Ag1+ que contienen ácido etilendiaminotetraacético y cloruro de bencetonio (Ag1+/EDTA/BC), y apósitos que contienen nitrato de plata (oxisales de Ag), que producen iones Ag1+, Ag2+ y Ag3+ para combatir la biopelícula de la herida y su efecto en la cicatrización. Los apósitos Ag1+ tuvieron efectos mínimos sobre la biopelícula de la herida in vitro y en ratones (C57BL/6j). En contraste, las sales de Ag oxigenadas y los apósitos Ag1+/EDTA/BC redujeron significativamente la cantidad de bacterias viables en biopelículas in vitro y demostraron una reducción significativa en los componentes bacterianos y de EPS en biopelículas de heridas de ratones. Estos apósitos tuvieron efectos diferentes en la cicatrización de heridas infectadas y no infectadas por biopelículas, siendo los apósitos de sales oxigenadas más beneficiosos para la reepitelización, el tamaño de la herida y la inflamación en comparación con los tratamientos de control y otros apósitos de plata. Las diferentes propiedades fisicoquímicas de los apósitos de plata pueden tener efectos distintos sobre la biopelícula y la cicatrización de la herida, lo cual debe considerarse al seleccionar un apósito para el tratamiento de heridas infectadas por biopelículas.
Las heridas crónicas se definen como «heridas que no progresan a través de las etapas normales de cicatrización de manera ordenada y oportuna»¹. Las heridas crónicas generan una carga psicológica, social y económica para los pacientes y el sistema de salud. El gasto anual del NHS en el tratamiento de heridas y comorbilidades asociadas se estima en 8300 millones de libras esterlinas en 2017-18². Las heridas crónicas también constituyen actualmente un problema acuciante en Estados Unidos, donde Medicare estima que el costo anual del tratamiento de pacientes con heridas oscila entre 28 100 y 96 800 millones de dólares³.
La infección es un factor importante que impide la cicatrización de las heridas. Las infecciones suelen manifestarse como biopelículas, presentes en el 78 % de las heridas crónicas que no cicatrizan. Las biopelículas se forman cuando los microorganismos se adhieren irreversiblemente a superficies, como las de las heridas, y pueden agregarse para formar comunidades productoras de polímeros extracelulares (EPS). La biopelícula en la herida se asocia con una mayor respuesta inflamatoria que provoca daño tisular, lo que puede retrasar o impedir la cicatrización⁴. El aumento del daño tisular puede deberse, en parte, a una mayor actividad de las metaloproteinasas de matriz, la colagenasa, la elastasa y las especies reactivas de oxígeno⁵. Además, las células inflamatorias y las biopelículas son grandes consumidoras de oxígeno y, por lo tanto, pueden causar hipoxia tisular local, privando a las células del oxígeno vital necesario para una reparación tisular eficaz⁶.
Los biofilms maduros son altamente resistentes a los agentes antimicrobianos, lo que exige estrategias agresivas para controlar las infecciones por biofilms, como el tratamiento mecánico seguido de un tratamiento antimicrobiano eficaz. Dado que los biofilms pueden regenerarse rápidamente, los antimicrobianos eficaces pueden reducir el riesgo de reformación tras el desbridamiento quirúrgico⁷.
La plata se utiliza cada vez más en apósitos antimicrobianos y a menudo como tratamiento de primera línea para heridas crónicas infectadas. Existen numerosos apósitos de plata disponibles comercialmente, cada uno con una composición, concentración y matriz base de plata diferentes. Los avances en los brazaletes de plata han propiciado el desarrollo de nuevos brazaletes. La forma metálica de la plata (Ag0) es inerte; para lograr la eficacia antimicrobiana, debe perder un electrón para formar plata iónica (Ag1+). Los apósitos de plata tradicionales contienen compuestos de plata o plata metálica que, al exponerse a líquidos, se descomponen para formar iones Ag1+. Estos iones Ag1+ reaccionan con la célula bacteriana, extrayendo electrones de componentes estructurales o procesos críticos necesarios para la supervivencia. La tecnología patentada ha llevado al desarrollo de un nuevo compuesto de plata, las oxisales de plata (nitrato de plata, Ag7NO11), que se incluyen en los apósitos para heridas. A diferencia de la plata tradicional, la descomposición de las sales que contienen oxígeno produce estados de plata con mayor valencia (Ag1+, Ag2+ y Ag3+). Estudios in vitro han demostrado que bajas concentraciones de sales de plata oxigenadas son más efectivas que la plata de iones simples (Ag1+) contra bacterias patógenas como Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Escherichia coli8,9. Otro nuevo tipo de apósito de plata incluye ingredientes adicionales, a saber, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y cloruro de bencetonio (BC), que se informa que actúan sobre la EPS del biofilm y, por lo tanto, aumentan la penetración de la plata en el biofilm. Estas nuevas tecnologías de plata ofrecen nuevas formas de atacar los biofilms de las heridas. Sin embargo, el impacto de estos antimicrobianos en el entorno de la herida y la cicatrización independiente de la infección es importante para asegurar que no creen un entorno desfavorable en la herida ni retrasen la cicatrización. Se han reportado preocupaciones sobre la citotoxicidad de la plata in vitro con varios apósitos de plata10,11. Sin embargo, la citotoxicidad in vitro aún no se ha traducido en toxicidad in vivo, y varios apósitos de Ag1+ han demostrado un buen perfil de seguridad12.
En este estudio, investigamos la eficacia de los apósitos de carboximetilcelulosa que contienen nuevas formulaciones de plata contra el biofilm de heridas, tanto in vitro como in vivo. Además, se evaluaron los efectos de estos apósitos sobre las respuestas inmunitarias y la cicatrización, independientemente de la infección.
Todos los apósitos utilizados estaban disponibles comercialmente. El apósito de fibra de gel 3M Kerracel (3M, Knutsford, Reino Unido) es un apósito de fibra de gel de carboximetilcelulosa (CMC) 100% no antimicrobiano que se utilizó como apósito de control en este estudio. Se evaluaron tres apósitos de plata CMC antimicrobianos, a saber, el apósito 3M Kerracel Ag (3M, Knutsford, Reino Unido), que contiene 1,7 % en peso de sal de plata oxigenada (Ag7NO11) en iones de plata de valencia superior (Ag1+, Ag2+ y Ag3+). Durante la descomposición de Ag7NO11, los iones Ag1+, Ag2+ y Ag3+ se forman en una proporción de 1:2:4. Apósito Aquacel Ag Extra que contiene 1,2 % de cloruro de plata (Ag1+) (ConvaTec, Deeside, Reino Unido) 13 y apósito Aquacel Ag + Extra que contiene 1,2 % de cloruro de plata (Ag1+), EDTA y cloruro de benzetonio (ConvaTec, Deeside, Reino Unido) 14.
Las cepas utilizadas en este estudio fueron Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) y Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Las bacterias se cultivaron durante la noche en caldo Mueller-Hinton (Oxoid, Altrincham, Reino Unido). El cultivo nocturno se diluyó 1:100 en caldo Mueller-Hinton y se sembraron 200 µl en membranas estériles de cicloporo Whatman de 0,2 µm (Whatman plc, Maidstone, Reino Unido) en placas de agar Mueller-Hinton (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Gran Bretaña). Formación de biopelículas coloniales a 37 °C durante 24 horas. Estas biopelículas coloniales se analizaron para detectar la contracción logarítmica.
Corte el apósito en trozos cuadrados de 3 cm² y humedézcalo previamente con agua desionizada estéril. Coloque el apósito sobre la biopelícula de la colonia en la placa de agar. Cada 24 horas se eliminó la biopelícula y se cuantificaron las bacterias viables dentro de ella (UFC/ml) mediante dilución seriada (10⁻¹ a 10⁻⁷) en caldo de neutralización Day-Angle (Merck-Millipore). Tras 24 horas de incubación a 37 °C, se realizaron recuentos en placa estándar en placas de agar Mueller-Hinton. Cada tratamiento y punto temporal se realizó por triplicado, y los recuentos en placa se repitieron para cada dilución.
La piel de panceta de cerdo se obtiene de cerdas Large White dentro de los 15 minutos posteriores al sacrificio de acuerdo con las normas de exportación de la Unión Europea. La piel se afeitó y limpió con toallitas de alcohol, luego se congeló a -80 °C durante 24 horas para desvitalizarla. Después de la descongelación, trozos de piel de 1 cm2 se lavaron tres veces con PBS, hipoclorito de sodio al 0,6 % y etanol al 70 % durante 20 minutos cada vez. Antes de retirar la epidermis, elimine cualquier resto de etanol lavando 3 veces en PBS estéril. La piel se cultivó en una placa de 6 pocillos con una membrana de nailon de 0,45 μm de espesor (Merck-Millipore) en la parte superior y 3 almohadillas absorbentes (Merck-Millipore) que contenían 3 ml de suero fetal bovino (Sigma) suplementado con 10 % de medio Dulbecco's Modified Eagle (Dulbecco's Modified Eagle Medium – Aldrich Ltd.).
Se cultivaron biopelículas coloniales como se describe para los estudios de exposición a biopelículas. Después de cultivar la biopelícula en la membrana durante 72 horas, se aplicó a la superficie de la piel con un asa de inoculación estéril y se retiró la membrana. A continuación, la biopelícula se incubó en la dermis del cerdo durante 24 horas adicionales a 37 °C para permitir su maduración y adhesión a la piel. Una vez madurada y adherida la biopelícula, se aplicó un apósito de 1,5 cm², previamente humedecido con agua destilada estéril, directamente sobre la superficie de la piel y se incubó a 37 °C durante 24 horas. Las bacterias viables se visualizaron mediante tinción, aplicando uniformemente el reactivo de viabilidad celular PrestoBlue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Reino Unido) a la superficie apical de cada explante e incubándolo durante 5 minutos. Utilice la cámara digital Leica DFC425 para capturar imágenes instantáneamente en el microscopio Leica MZ8. Las áreas coloreadas de rosa se cuantificaron utilizando el software Image Pro versión 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (mediacy.com)). La microscopía electrónica de barrido se realizó como se describe a continuación.
Las bacterias cultivadas durante la noche se diluyeron 1:100 en caldo Mueller-Hinton. Se añadieron 200 μl de cultivo a una membrana ciclópora Whatman estéril de 0,2 μm (Whatman, Maidstone, Reino Unido) y se sembraron en agar Mueller-Hinton. Las placas de biopelícula se incubaron a 37 °C durante 72 horas para permitir la formación de una biopelícula madura.
Tras tres días de maduración del biofilm, se colocó un vendaje cuadrado de 3 cm² directamente sobre el biofilm y se incubó a 37 °C durante 24 horas. Después de retirar el vendaje de la superficie del biofilm, se añadió 1 ml del reactivo de viabilidad celular PrestoBlue (Invitrogen, Waltham, MA) a la superficie de cada biofilm durante 20 segundos. Las superficies se secaron antes de registrar los cambios de color con una cámara digital Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, Reino Unido).
Prepare cultivos nocturnos en agar Mueller-Hinton, transfiera colonias individuales a 10 ml de caldo Mueller-Hinton e incúbelas en un agitador a 37 °C (100 rpm). Después de la incubación nocturna, el cultivo se diluyó 1:100 en caldo Mueller-Hinton y se depositaron 300 µl sobre una membrana circular Whatman Cyclopore de 0,2 µm (Whatman International, Maidstone, Reino Unido) en agar Mueller-Hinton y se incubó a 37 °C durante 72 horas. El biofilm maduro se aplicó a la herida como se describe a continuación.
Todo el trabajo con animales se realizó en la Universidad de Manchester bajo una licencia de proyecto aprobada por la Oficina de Bienestar Animal y Revisión Ética (P8721BD27) y de acuerdo con las directrices publicadas por el Ministerio del Interior bajo la ASPA revisada de 2012. Todos los autores se adhirieron a las directrices de llegada. Se utilizaron ratones C57BL/6j de ocho semanas de edad (Envigo, Oxon, Reino Unido) para todos los estudios in vivo. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Reino Unido) y sus superficies dorsales fueron afeitadas y limpiadas. Luego, a cada ratón se le hizo una herida de escisión de 2 × 6 mm usando un punzón de biopsia Stiefel (Schuco International, Hertfordshire, Reino Unido). Para heridas infectadas con biopelícula, aplique biopelícula colonial de 72 horas cultivada en la membrana como se describió anteriormente a la capa dérmica de la herida usando un asa de inoculación estéril inmediatamente después de la lesión y deseche la membrana. Un centímetro cuadrado de apósito se humedeció previamente con agua estéril para mantener un ambiente húmedo en la herida. Los apósitos se aplicaron directamente sobre cada herida y se cubrieron con una película 3M Tegaderm (3M, Bracknell, Reino Unido) y adhesivo líquido Mastisol (Eloquest Healthcare, Ferndale, Michigan) aplicado alrededor de los bordes para proporcionar una mayor adhesión. Se administró buprenorfina (Animalcare, York, Reino Unido) a una concentración de 0,1 mg/kg como analgésico. Los ratones se sacrificaron tres días después de la lesión utilizando el método del Programa 1 y se extrajo, se cortó por la mitad y se almacenó el área de la herida según fuera necesario.
La tinción con hematoxilina (ThermoFisher Scientific) y eosina (ThermoFisher Scientific) se realizó siguiendo el protocolo del fabricante. El área de la herida y la reepitelización se cuantificaron utilizando el software Image Pro versión 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Las secciones de tejido se desparafinaron en xileno (ThermoFisher Scientific, Loughborough, Reino Unido), se rehidrataron con etanol en concentraciones crecientes del 100 al 50 % y se sumergieron brevemente en agua desionizada (ThermoFisher Scientific). La inmunohistoquímica se realizó utilizando el kit VectaStain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) según el protocolo del fabricante. Los anticuerpos primarios para neutrófilos NIMP-R14 (ThermoFisher Scientific) y macrófagos Ms CD107b Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, Reino Unido) se diluyeron 1:100 en solución de bloqueo y se añadieron a la superficie de corte, seguidos de 2 anticuerpos Anti-, VectaStain ABC y el kit de sustrato de peroxidasa (HRP) Vector Nova Red (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y se contratiñeron con hematoxilina. Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio Olympus BX43 y una cámara digital Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, Reino Unido).
Las muestras de piel se fijaron en glutaraldehído al 2,5 % y formaldehído al 4 % en HEPES 0,1 M (pH 7,4) durante 24 horas a 4 °C. Las muestras se deshidrataron con etanol en concentraciones crecientes y se secaron con CO2 utilizando un secador de punto crítico Quorum K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Reino Unido). Posteriormente, se recubrieron con una aleación de oro-paladio mediante pulverización catódica con un sistema de descarga luminiscente/pulverizador Quorum SC7620. Las muestras se analizaron con un microscopio electrónico de barrido FEI Quanta 250 (ThermoFisher Scientific) para visualizar el punto central de la herida.
Se aplicó yoduro de Toto-1 (2 μM) a la superficie de la herida extirpada del ratón y se incubó durante 5 minutos a 37 °C (ThermoFisher Scientific). Posteriormente, se trató con Syto-60 (10 μM) a 37 °C (ThermoFisher Scientific). Se crearon imágenes en pila Z de 15 minutos utilizando un Leica TCS SP8.
Los datos biológicos y técnicos replicados se tabularon y analizaron con el software GraphPad Prism V9 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Se utilizó un análisis de varianza unidireccional con comparaciones múltiples mediante la prueba post hoc de Dunnett para evaluar las diferencias entre cada tratamiento y el apósito de control no antimicrobiano. Se consideró significativo un valor de p < 0,05.
La efectividad de los apósitos fibrosos de gel de plata se evaluó primero contra colonias de biopelícula de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa in vitro. Los apósitos de plata contienen diferentes fórmulas de plata: los apósitos de plata tradicionales producen iones Ag1+; los apósitos de plata, que pueden producir iones Ag1+ después de la adición de EDTA/BC, pueden destruir la matriz de la biopelícula y exponer las bacterias a la plata bajo el efecto antibacteriano de la plata. iones15 y apósitos que contienen sales de Ag oxigenadas que producen iones Ag1+, Ag2+ y Ag3+. Su efectividad se comparó con un apósito de control no antimicrobiano hecho de fibras gelificadas. Las bacterias viables restantes dentro de la biopelícula se evaluaron cada 24 horas durante 8 días (Figura 1). El día 5, la biopelícula se reinoculó con 3,85 × 105S. Staphylococcus aureus o 1,22 × 105P. aeruginosa para evaluar la recuperación de la biopelícula. En comparación con los apósitos de control no antimicrobianos, los apósitos con Ag1+ tuvieron un efecto mínimo sobre la viabilidad bacteriana en biopelículas de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa durante 5 días. Por el contrario, los apósitos que contenían Ag oxigenado y sales de Ag1+ + EDTA/BC fueron eficaces para eliminar las bacterias dentro de la biopelícula en 5 días. Tras la inoculación repetida con bacterias planctónicas el día 5, no se observó ninguna recuperación de la biopelícula (Fig. 1).
Cuantificación de bacterias viables en biopelículas de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa tras el tratamiento con apósitos de plata. Se trataron colonias de biopelículas de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa con apósitos de plata o apósitos de control no antimicrobianos, y se determinó el número de bacterias viables restantes cada 24 horas. Tras 5 días, la biopelícula se reinoculó con 3,85 × 10⁵ S de Staphylococcus aureus o 1,22 × 10⁵ P de Pseudomonas aeruginosa. Se formaron colonias de la bacteria planctónica Pseudomonas aeruginosa individualmente para evaluar la recuperación de la biopelícula. Los gráficos muestran la media ± el error estándar.
Para visualizar el efecto de los apósitos de plata sobre la viabilidad del biofilm, se aplicaron apósitos a biofilms maduros cultivados en piel porcina ex vivo. Después de 24 horas, se retiró el apósito y el biofilm se tiñó con un colorante reactivo azul, que las bacterias vivas metabolizan a un color rosa. Los biofilms tratados con apósitos de control eran rosas, lo que indica la presencia de bacterias viables dentro del biofilm (Figura 2A). Por el contrario, el biofilm tratado con el apósito de oxisoles de Ag era principalmente azul, lo que indica que las bacterias restantes en la superficie de la piel del cerdo eran bacterias no viables (Figura 2B). Se observó una coloración mixta azul y rosa en los biofilms tratados con apósitos que contenían Ag1+, lo que indica la presencia de bacterias viables y no viables dentro del biofilm (Figura 2C), mientras que los apósitos de EDTA/BC que contenían Ag1+ eran predominantemente azules con algunas manchas rosas, lo que indica áreas no afectadas por el apósito de plata (Figura 2D). La cuantificación de las áreas activas (rosa) e inactivas (azul) mostró que el parche de control era 75% activo (Figura 2E). Los apósitos Ag1+ + EDTA/BC se comportaron de manera similar a los apósitos de sal de Ag oxigenada, con tasas de supervivencia del 13% y 14%, respectivamente. El apósito Ag1+ también redujo la viabilidad bacteriana en un 21%. Estos biofilms se observaron luego usando microscopía electrónica de barrido (MEB). Después del tratamiento con el apósito de control y el apósito Ag1+, se observó una capa de Pseudomonas aeruginosa cubriendo la piel porcina (Figura 2F,H), mientras que después del tratamiento con el apósito Ag1+, se encontraron pocas células bacterianas y pocas células bacterianas se encontraron debajo. Las fibras de colágeno pueden considerarse como la estructura tisular de la piel porcina (Figura 2G). Después del tratamiento con el apósito Ag1+ + EDTA/BC, las placas bacterianas y las placas de fibras de colágeno subyacentes fueron visibles (Figura 2I).
Visualización de biopelículas de Pseudomonas aeruginosa después del tratamiento con apósitos de plata. (A–D) La viabilidad bacteriana en biopelículas de Pseudomonas aeruginosa cultivadas en piel porcina se visualizó utilizando el colorante de viabilidad PrestoBlue 24 horas después del tratamiento con apósitos de plata o apósitos de control no antimicrobianos. Las bacterias vivas son rosas, las bacterias no viables y la piel de cerdo son azules. (E) Cuantificación de biopelículas de Pseudomonas aeruginosa cultivadas en piel porcina (punto rosa) utilizando microscopía electrónica de barrido Image Pro versión 10 (FI) y tratadas con un apósito de plata o un apósito de control no antimicrobiano durante 24 horas. Barra de escala SEM = 5 µm. (J–M) Las biopelículas coloniales crecieron en filtros y se tiñeron con el colorante reactivo PrestoBlue después de 24 h de incubación con apósitos de plata.
Para determinar si el contacto cercano entre los apósitos y los biofilms afectaba la eficacia de los apósitos, se trataron biofilms coloniales colocados sobre una superficie plana con los apósitos durante 24 horas y luego se tiñeron con colorantes reactivos. El biofilm no tratado era de color rosa oscuro (Figura 2J). En contraste con los biofilms tratados con apósitos que contenían sales de Ag oxigenadas (Figura 2K), los biofilms tratados con apósitos que contenían Ag1+ o Ag1+ + EDTA/BC mostraron bandas de tinción rosa (Figura 2L,M). Esta coloración rosa indica la presencia de bacterias viables y está asociada con el área de sutura dentro del apósito. Estas áreas cosidas crean espacios muertos que permiten la supervivencia de las bacterias dentro del biofilm.
Para evaluar la efectividad de los apósitos de plata in vivo, se trataron heridas de espesor total de ratones infectados con biopelículas maduras de S. aureus y P. aeruginosa con apósitos de control no antimicrobianos o apósitos de plata. Después de 3 días de tratamiento, el análisis de imágenes macroscópicas mostró tamaños de herida más pequeños cuando se trataron con apósitos de sal oxigenada en comparación con los apósitos de control no antimicrobianos y otros apósitos de plata (Figura 3A-H). Para confirmar estas observaciones, se extrajeron las heridas y se cuantificó el área de la herida y la reepitelización en secciones de tejido teñidas con hematoxilina y eosina utilizando el software Image Pro versión 10 (Figura 3I-L).
Efecto de los apósitos de plata en la superficie de la herida y la reepitelización de heridas infectadas con biopelículas. (A–H) Células pequeñas infectadas con biopelículas de Pseudomonas aeruginosa (A–D) y Staphylococcus aureus (E–H) después de tres días de tratamiento con un apósito de control no antimicrobiano, un apósito de sal de Ag oxigenada, un apósito de Ag1+ y un apósito de Ag1+. Imágenes macroscópicas representativas. Heridas de ratones con apósito de Ag1+ + EDTA/BC. (IL) Infección representativa de Pseudomonas aeruginosa, secciones histológicas teñidas con hematoxilina y eosina, utilizadas para cuantificar el área de la herida y la regeneración epitelial. Cuantificación del área de la herida (M, O) y porcentaje de reepitelización (N, P) de heridas infectadas con biopelículas de Pseudomonas aeruginosa (M, N) y Staphylococcus aureus (O, P) (por grupo de tratamiento n = 12). Los gráficos muestran la media +/- el error estándar. * significa p = < 0,05 ** significa p = < 0,01; Escala macroscópica = 2,5 mm, escala histológica = 500 µm.
La cuantificación del área de la herida en heridas infectadas con biopelícula de Pseudomonas aeruginosa (Figura 3M) mostró que las heridas tratadas con oxisales de Ag tenían un tamaño promedio de herida de 2,5 mm2, mientras que el apósito de control no antimicrobiano tenía un tamaño promedio de herida de 3,1 mm2, lo cual no es cierto. alcanzó significación estadística (Figura 3M). p = 0,423). Las heridas tratadas con Ag1+ o Ag1+ + EDTA/BC no mostraron reducción en el área de la herida (3,1 mm2 y 3,6 mm2, respectivamente). El tratamiento con apósito de sal de Ag oxigenada promovió la reepitelización en mayor medida que el apósito de control no antimicrobiano (34% y 15%, respectivamente; p = 0,029) y Ag1+ o Ag1+ + EDTA/BC (10% y 11%) (Figura 3N). . , respectivamente).
Se observaron tendencias similares en el área de la herida y la regeneración epitelial en heridas infectadas con biopelículas de S. aureus (Figura 3O). Los apósitos que contenían sales de plata oxigenadas redujeron el área de la herida (2,0 mm2) en un 23% en comparación con el apósito de control no antimicrobiano (2,6 mm2), aunque esta reducción no fue significativa (p = 0,304) (Fig. 3O). Además, el área de la herida en el grupo de tratamiento con Ag1+ se redujo ligeramente (2,4 mm2), mientras que la herida tratada con el apósito Ag1+ + EDTA/BC no redujo el área de la herida (2,9 mm2). Las sales de oxígeno de Ag también promovieron la reepitelización de heridas infectadas con biopelículas de S. aureus (31%) en mayor medida que las tratadas con apósitos de control no antimicrobianos (12%, p = 0,003) (Figura 3P). Los apósitos Ag1+ (16%, p = 0,903) y Ag+1 + EDTA/BC (14%, p = 0,965) mostraron niveles de regeneración epitelial similares a los del control.
Para visualizar el efecto de los apósitos de plata en la matriz del biofilm, se realizó la tinción con yoduro de Toto 1 y Syto 60 (Fig. 4). El yoduro de Toto 1 es un colorante impermeable a las células que puede utilizarse para visualizar con precisión los ácidos nucleicos extracelulares, que son abundantes en el EPS de los biofilms. Syto 60 es un colorante permeable a las células utilizado como contratinción16. Las observaciones de yoduro de Toto 1 y Syto 60 en heridas inoculadas con biofilms de Pseudomonas aeruginosa (Figura 4A-D) y Staphylococcus aureus (Figura 4I-L) mostraron que después de 3 días de tratamiento con apósito, el EPS en el biofilm se redujo significativamente. que contenían sales oxigenadas Ag y Ag1+ + EDTA/BC. Los apósitos Ag1+ sin componentes antibiofilm adicionales redujeron significativamente el ADN libre de células en heridas inoculadas con Pseudomonas aeruginosa pero fueron menos efectivos en heridas inoculadas con Staphylococcus aureus.
Imágenes in vivo de biopelículas de heridas después de 3 días de tratamiento con apósitos de control o de plata. Imágenes confocales de Pseudomonas aeruginosa (A–D) y Staphylococcus aureus (I–L) teñidas con Toto 1 (verde) para visualizar ácidos nucleicos extracelulares, un componente de los polímeros de biopelícula extracelular. Para teñir ácidos nucleicos intracelulares, utilice Syto 60 (rojo). ácidos. P. Microscopía electrónica de barrido de heridas infectadas con biopelículas de Pseudomonas aeruginosa (E–H) y Staphylococcus aureus (M–P) después de 3 días de tratamiento con apósitos de control y de plata. Barra de escala SEM = 5 µm. Barra de escala de imágenes confocales = 50 µm.
La microscopía electrónica de barrido mostró que los ratones inoculados con colonias de biopelículas de Pseudomonas aeruginosa (Figura 4E-H) y Staphylococcus aureus (Figura 4M-P) tenían significativamente menos bacterias en sus heridas después de 3 días de tratamiento con todos los apósitos de plata.
Para evaluar el efecto de los apósitos de plata en la inflamación de heridas en ratones infectados con biopelículas, secciones de heridas infectadas con biopelículas tratadas con apósitos de control o de plata durante 3 días se tiñeron inmunohistoquímicamente utilizando anticuerpos específicos para neutrófilos y macrófagos. Determinación cuantitativa de neutrófilos y macrófagos internamente. tejido de granulación. Figura 5). Todos los apósitos de plata redujeron el número de neutrófilos y macrófagos en heridas infectadas con Pseudomonas aeruginosa en comparación con los apósitos de control no antimicrobianos después de tres días de tratamiento. Sin embargo, el tratamiento con el apósito de sal de plata oxigenada resultó en una mayor reducción de neutrófilos (p = <0,0001) y macrófagos (p = <0,0001) en comparación con otros apósitos de plata probados (Figura 5I,J). Aunque Ag1+ + EDTA/BC tuvo un mayor efecto sobre la biopelícula de la herida, redujo los niveles de neutrófilos y macrófagos en menor medida que el apósito Ag1+. También se observaron heridas moderadas infectadas con biopelícula de S. aureus después del vendaje con Ag (p = <0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) y Ag1++ EDTA/BC (p = 0,0043) oxisoles en comparación con el control. Se observan tendencias similares para la neutropenia. vendaje (Fig. 5K). Sin embargo, solo el vendaje de sal de Ag oxigenada mostró una reducción significativa en el número de macrófagos en el tejido de granulación en comparación con el control en heridas infectadas con biopelículas de S. aureus (p = 0,0339) (Figura 5L).
Se cuantificaron neutrófilos y macrófagos en heridas infectadas con biopelículas de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus después de 3 días de tratamiento con apósitos de control no antimicrobianos o de plata. Los neutrófilos (AD) y los macrófagos (EH) se cuantificaron en secciones de tejido teñidas con anticuerpos específicos para neutrófilos o macrófagos. Cuantificación de neutrófilos (I y K) y macrófagos (J y L) en heridas infectadas con biopelículas de Pseudomonas aeruginosa (I y J) y Staphylococcus aureus (K y L). N = 12 por grupo. Los gráficos muestran la media ± error estándar, valores de significancia en comparación con el apósito de control no antibacteriano, * significa p = < 0,05, ** significa p = < 0,01; *** significa p = < 0,001; indica p = <0,0001).
Luego evaluamos el efecto de los apósitos de plata en la cicatrización independiente de la infección. Las heridas de escisión no infectadas se trataron con un apósito de control no antimicrobiano o un apósito de plata durante 3 días (Figura 6). Entre los apósitos de plata probados, solo las heridas tratadas con el apósito de sal oxigenada parecían más pequeñas en las imágenes macroscópicas que las heridas tratadas con el control (Figura 6A-D). La cuantificación del área de la herida mediante análisis histológico mostró que el área promedio de la herida después del tratamiento con el apósito de oxisoles de Ag fue de 2,35 mm2 en comparación con 2,96 mm2 para las heridas tratadas con el grupo de control, pero esta diferencia no alcanzó significación estadística (p = 0,488) (Fig. 6I). Por el contrario, no se observó reducción en el área de la herida después del tratamiento con apósitos de Ag1+ (3,38 mm2, p = 0,757) o Ag1+ + EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) en comparación con el grupo de control. Se observó una mayor regeneración epitelial con el apósito de oxisol de Ag en comparación con el grupo control (30% vs. 22%, respectivamente), aunque esto no alcanzó significación (p = 0,067), es bastante significativo y confirma resultados previos. Un apósito con oxisoles promueve la reepitelización. -Epitelización de heridas no infectadas17. Por el contrario, el tratamiento con apósitos de Ag1+ o Ag1+ + EDTA/BC no tuvo efecto o mostró una reepitelización disminuida en comparación con el control.
Efecto del apósito de plata en la cicatrización de heridas en ratones no infectados con resección completa. (AD) Imágenes macroscópicas representativas de heridas después de tres días de tratamiento con un apósito de control no antimicrobiano y un apósito de plata. (EH) Secciones representativas de heridas teñidas con hematoxilina y eosina. La cuantificación del área de la herida (I) y el porcentaje de reepitelización (J) se calcularon a partir de secciones histológicas en el punto medio de la herida utilizando un software de análisis de imágenes (n = 11–12 por grupo de tratamiento). Los gráficos muestran la media ± error estándar. * significa p = <0,05.
La plata tiene una larga historia de uso como terapia antimicrobiana en la cicatrización de heridas, pero las diferentes formulaciones y métodos de administración pueden generar diferencias en la eficacia antimicrobiana 18. Además, las propiedades antibiopelícula de los sistemas de administración de plata específicos no se comprenden completamente. Si bien la respuesta inmune del huésped es relativamente eficaz contra las bacterias planctónicas, generalmente es menos eficaz contra las biopelículas19. Las bacterias planctónicas son fagocitadas fácilmente por los macrófagos, pero dentro de las biopelículas, las células agregadas plantean problemas adicionales al limitar la respuesta del huésped hasta el punto en que las células inmunes pueden sufrir apoptosis y liberar factores proinflamatorios para potenciar la respuesta inmune20. Se ha observado que algunos leucocitos pueden penetrar las biopelículas21 pero son incapaces de fagocitar bacterias una vez que esta defensa se ve comprometida22. Se debe utilizar un enfoque holístico para apoyar la respuesta inmune del huésped contra la infección por biopelícula en la herida. El desbridamiento de la herida puede desintegrar físicamente la biopelícula y eliminar la mayor parte de la carga biológica, pero la respuesta inmune del huésped puede ser ineficaz contra la biopelícula restante, especialmente si la respuesta inmune del huésped está comprometida. Así, las terapias antimicrobianas, como los apósitos de plata, pueden reforzar la respuesta inmunitaria del huésped y eliminar las infecciones por biopelículas. La composición, la concentración, la solubilidad y el sustrato de administración influyen en la eficacia antimicrobiana de la plata. En los últimos años, los avances en la tecnología de procesamiento de la plata han mejorado la eficacia de estos apósitos9,23. A medida que avanza la tecnología de los apósitos de plata, es fundamental comprender su eficacia para controlar la infección de las heridas y, aún más importante, el impacto de estas potentes formas de plata en el entorno de la herida y su cicatrización.
En este estudio, comparamos la eficacia de dos apósitos de plata avanzados con apósitos de plata convencionales que producen iones Ag1+ contra biopelículas, utilizando diferentes modelos in vitro e in vivo. También evaluamos el efecto de estos apósitos en el entorno de la herida y la cicatrización independiente de la infección. Para minimizar la influencia de la matriz de liberación, todos los apósitos de plata probados estaban compuestos de carboximetilcelulosa.
Nuestra evaluación preliminar de estos apósitos de plata contra biopelículas coloniales de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus muestra que, a diferencia de los apósitos tradicionales de Ag1+, dos apósitos de plata avanzados, Ag1+ + EDTA/BC y sales de Ag oxigenadas, son eficaces a 5. Eliminan eficazmente las bacterias de la biopelícula en pocos días. Además, estos apósitos previenen la reformación de la biopelícula tras la exposición repetida a bacterias planctónicas. El apósito de Ag1+ contenía cloruro de plata, el mismo compuesto de plata y matriz base que Ag1+ + EDTA/BC, y tuvo un efecto limitado sobre la viabilidad bacteriana dentro de la biopelícula durante el mismo período. La observación de que un apósito de Ag1+ + EDTA/BC fue más eficaz contra la biopelícula que un apósito de Ag1+ compuesto por la misma matriz y un compuesto de plata respalda la idea de que se requieren ingredientes adicionales para aumentar la eficacia del cloruro de plata contra la biopelícula, como se ha informado en otros lugares15. Estos resultados respaldan la idea de que el BC y el EDTA desempeñan un papel adicional que contribuye a la eficacia general del apósito, y que la ausencia de este componente en los apósitos de Ag1+ puede haber contribuido a la falta de demostración de eficacia in vitro. Observamos que los apósitos de sal de Ag oxigenada que producen iones Ag2+ y Ag3+ mostraron una mayor eficacia antibacteriana que el Ag1+ y a niveles similares a los de Ag1+ + EDTA/BC. Sin embargo, debido al alto potencial redox, no está claro cuánto tiempo permanecen activos y eficaces los iones Ag3+ contra los biofilms de las heridas, por lo que merecen un estudio más profundo. Además, existen muchos apósitos diferentes que generan iones Ag1+ que no se probaron en este estudio. Estos apósitos están compuestos de diferentes compuestos de plata, concentraciones y matrices base, lo que puede influir en la liberación de iones Ag1+ y su eficacia contra los biofilms. También cabe destacar que se utilizan muchos modelos in vitro e in vivo diferentes para evaluar la eficacia de los apósitos contra los biofilms. El tipo de modelo utilizado, así como el contenido de sal y proteínas de los medios utilizados en estos modelos, influirán en la eficacia del apósito. En nuestro modelo in vivo, permitimos que el biofilm madurara in vitro y luego lo transferimos a la superficie dérmica de la herida. La respuesta inmunitaria del ratón huésped es relativamente eficaz contra las bacterias planctónicas aplicadas a la herida, lo que permite la formación de un biofilm durante el proceso de cicatrización. La adición de un biofilm maduro a la herida limita la eficacia de la respuesta inmunitaria del huésped a la formación del biofilm, ya que permite que este se establezca dentro de la herida antes de que comience la cicatrización. Por lo tanto, nuestro modelo nos permite evaluar la eficacia de los apósitos antimicrobianos sobre biofilms maduros antes de que las heridas comiencen a cicatrizar.
También observamos que el ajuste del apósito influyó en la eficacia de los apósitos de plata en biopelículas cultivadas in vitro y en piel porcina. El contacto estrecho con la herida se considera fundamental para la eficacia antimicrobiana del apósito24,25. Los apósitos que contenían sales de Ag oxigenadas estaban en contacto directo con biopelículas maduras, lo que resultó en una reducción significativa del número de bacterias viables dentro de la biopelícula después de 24 horas. En cambio, cuando se trataron con apósitos de Ag1+ y Ag1+ + EDTA/BC, se mantuvo un número significativo de bacterias viables. Estos apósitos contienen suturas a lo largo de toda su extensión, lo que crea espacios muertos que impiden el contacto directo con la biopelícula. En nuestros estudios in vitro, estas áreas sin contacto impidieron la eliminación de bacterias viables dentro de la biopelícula. Evaluamos la viabilidad bacteriana solo después de 24 horas de tratamiento; con el tiempo, a medida que el apósito se satura, puede haber menos espacio muerto, reduciendo el área para estas bacterias viables. Sin embargo, esto resalta la importancia de la composición del apósito, no solo del tipo de plata que contiene.
Si bien los estudios in vitro son útiles para comparar la eficacia de diferentes tecnologías de plata, también es importante comprender los efectos de estos apósitos sobre los biofilms in vivo, donde el tejido del huésped y las respuestas inmunitarias contribuyen a la eficacia de los apósitos contra los biofilms. El efecto de estos apósitos sobre los biofilms de las heridas se observó mediante microscopía electrónica de barrido y tinción de EPS del biofilm utilizando colorantes de ADN intracelular y extracelular. Descubrimos que, después de 3 días de tratamiento, todos los apósitos fueron eficaces para reducir el ADN libre de células en heridas infectadas con biofilm, pero el apósito Ag1+ fue menos eficaz en heridas infectadas con Staphylococcus aureus. La microscopía electrónica de barrido también mostró que había significativamente menos bacterias en las heridas tratadas con los apósitos de plata, aunque esto fue más pronunciado con el apósito de sal de Ag oxigenada y el apósito Ag1+ + EDTA/BC en comparación con el apósito Ag1+. Estos datos demuestran que los apósitos de plata analizados tuvieron distintos grados de impacto en la estructura del biofilm, pero ninguno logró erradicarlo por completo. Esto respalda la necesidad de un enfoque integral para el tratamiento de las infecciones por biofilm en heridas, como el uso de brazaletes de plata. El tratamiento se inicia con un desbridamiento físico para eliminar la mayor parte del biofilm.
Las heridas crónicas suelen presentar una inflamación severa, con un exceso de células inflamatorias que permanecen en el tejido durante un período prolongado, causando daño tisular y agotando el oxígeno necesario para un metabolismo y funcionamiento celular eficientes en la herida.²⁶ Los biofilms exacerban este entorno hostil de la herida al afectar negativamente la cicatrización de diversas maneras, incluyendo la inhibición de la proliferación y migración celular y la activación de citocinas proinflamatorias.²⁷ A medida que los apósitos de plata se vuelven más efectivos, es importante comprender el impacto que tienen en el entorno de la herida y la cicatrización.
Curiosamente, aunque todos los apósitos de plata afectaron la composición del biofilm, solo los apósitos de sales de plata oxigenadas aumentaron la reepitelización de estas heridas infectadas. Estos datos respaldan nuestros hallazgos previos¹⁷ y los de Kalan et al. (2017)²⁸, que demostraron buenos perfiles de seguridad y toxicidad de las sales de plata oxigenadas, ya que concentraciones más bajas de plata fueron efectivas contra los biofilms.
Nuestro estudio actual destaca las diferencias en la tecnología de plata entre los apósitos de plata antimicrobianos y el impacto de esta tecnología en el entorno de la herida y la cicatrización independiente de la infección. Sin embargo, estos resultados difieren de estudios previos que muestran que el apósito Ag1+ + EDTA/BC mejoró los parámetros de cicatrización de orejas de conejo lesionadas in vivo. Sin embargo, esto puede deberse a diferencias en los modelos animales, los tiempos de medición y los métodos de aplicación bacteriana29. En este caso, las mediciones de la herida se tomaron 12 días después de la lesión para permitir que los ingredientes activos del apósito actuaran sobre el biofilm durante un período de tiempo más prolongado. Esto está respaldado por un estudio que mostró que las úlceras de pierna clínicamente infectadas tratadas con Ag1+ + EDTA/BC inicialmente aumentaron de tamaño después de una semana de tratamiento, y luego durante las siguientes 3 semanas de tratamiento con Ag1+ + EDTA/BC y dentro de las 4 semanas de uso de medicamentos no antimicrobianos. apósitos de CMC para reducir el tamaño de las úlceras30.
Se ha demostrado previamente que ciertas formas y concentraciones de plata son citotóxicas in vitro 11, pero estos resultados in vitro no siempre se traducen en efectos adversos in vivo. Además, los avances en la tecnología de la plata y una mejor comprensión de los compuestos y concentraciones de plata en los apósitos han llevado al desarrollo de muchos apósitos de plata seguros y eficaces. Sin embargo, a medida que avanza la tecnología de los apósitos de plata, es importante comprender el impacto de estos apósitos en el entorno de la herida31,32,33. Se informó previamente que el aumento de la tasa de reepitelización corresponde a una mayor proporción de macrófagos M2 antiinflamatorios en comparación con el fenotipo M1 proinflamatorio. Esto se observó en un modelo de ratón previo donde se compararon apósitos de hidrogel de plata para heridas con sulfadiazina de plata e hidrogeles no antimicrobianos34.
Las heridas crónicas pueden presentar inflamación excesiva y se ha observado que la presencia de un exceso de neutrófilos puede ser perjudicial para la cicatrización de heridas35. En un estudio en ratones con depleción de neutrófilos, la presencia de neutrófilos retrasó la reepitelización. La presencia de un exceso de neutrófilos conduce a altos niveles de proteasas y especies reactivas de oxígeno, como el superóxido y el peróxido de hidrógeno, que están asociados con heridas crónicas y de cicatrización lenta37,38. Del mismo modo, un aumento en el número de macrófagos, si no se controla, puede conducir a una cicatrización tardía de heridas39. Este aumento es particularmente importante si los macrófagos no pueden pasar de un fenotipo proinflamatorio a un fenotipo procicatrizante, lo que resulta en que las heridas no salgan de la fase inflamatoria de la cicatrización40. Observamos una disminución de neutrófilos y macrófagos en heridas infectadas con biopelícula después de 3 días de tratamiento con todos los apósitos de plata, pero la disminución fue más pronunciada con los apósitos de sal oxigenada. Esta disminución puede ser consecuencia directa de la respuesta inmunitaria a la plata, de una menor carga microbiana o de que la herida se encuentre en una fase avanzada de cicatrización, lo que reduce la cantidad de células inmunitarias presentes en ella. La reducción del número de células inflamatorias en la herida puede favorecer un entorno propicio para su cicatrización. El mecanismo de acción de las oxisales de plata para promover la cicatrización independiente de la infección no está claro, pero su capacidad para producir oxígeno y eliminar niveles perjudiciales de peróxido de hidrógeno, un mediador de la inflamación, podría explicar este fenómeno y requiere estudios adicionales¹⁷.
Las heridas crónicas infectadas que no cicatrizan representan un problema tanto para médicos como para pacientes. Si bien muchos apósitos afirman tener eficacia antimicrobiana, la investigación rara vez se centra en otros factores clave que influyen en el microambiente de la herida. Este estudio demuestra que las distintas tecnologías de plata presentan diferente eficacia antimicrobiana y, lo que es más importante, diferentes efectos sobre el entorno de la herida y la cicatrización, independientemente de la infección. Aunque estos estudios in vitro e in vivo demuestran la eficacia de estos apósitos en el tratamiento de infecciones de heridas y en la promoción de la cicatrización, se necesitan ensayos controlados aleatorizados para evaluar su eficacia en la práctica clínica.
Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles a solicitud razonable del autor correspondiente.