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El crecimiento microbiano en heridas a menudo se manifiesta como biopelículas, que interfieren con la curación y son difíciles de erradicar. Los nuevos apósitos plateados afirman combatir las infecciones de las heridas, pero su eficacia antibiofilm y los efectos de curación independientes de la infección son generalmente desconocidos. Usando modelos de biopelículas in vitro e in vivo de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, informamos la efectividad de los apósitos generadores de iones AG1+; Los apósitos AG1+ que contienen ácido etilendiaminetraacético y cloruro de benzetonio (AG1+/EDTA/BC), y apósitos que contienen nitrato de plata (AG Oxysalts). , que producen iones Ag1+, Ag2+ y Ag3+ para combatir la biopelícula de la herida y su efecto sobre la curación. Los apósitos AG1+ tuvieron efectos mínimos en la biopelícula de la herida in vitro y en ratones (C57BL/6J). En contraste, las sales de Ag oxigenadas y los apósitos AG1+/EDTA/BC redujeron significativamente el número de bacterias viables en biopelículas in vitro y demostró una reducción significativa en los componentes bacterianos y EPS en biopelículas de la herida de ratón. Estos apósitos tuvieron diferentes efectos sobre la curación de heridas infectadas con biopelículas y no infectadas con biofilm, con apósitos de sal oxigenados que tienen efectos más beneficiosos sobre la reepitelización, el tamaño de la herida e inflamación en comparación con los tratamientos de control y otros apósitos de plata. Las diferentes propiedades fisicoquímicas de los apósitos de plata pueden tener diferentes efectos sobre la biopelícula y la curación de la herida, y esto debe considerarse al seleccionar un aderezo para el tratamiento de heridas infectadas con biopelícula.
Las heridas crónicas se definen como "heridas que no pueden progresar a través de las etapas normales de curación de manera ordenada y oportuna" 1. Las heridas crónicas crean una carga psicológica, social y económica para los pacientes y el sistema de salud. El gasto anual del NHS en el tratamiento de heridas y comorbilidades asociadas se estima en £ 8.3 mil millones en 2017-182. Las heridas crónicas también son actualmente un problema apremiante en los Estados Unidos, y Medicare estima el costo anual de tratar pacientes con heridas en $ 28.1– $ 96.8 mil millones3.
La infección es un factor importante que previene la curación de heridas. Las infecciones a menudo se manifiestan como biopelículas, que están presentes en el 78% de las heridas crónicas no curativas. Las biopelículas se forman cuando los microorganismos se unen irreversiblemente a las superficies, como las superficies de las heridas, y pueden agregarse para formar comunidades productoras de polímeros extracelulares (EPS). La biopelícula de la herida se asocia con un aumento de la respuesta inflamatoria que conduce al daño tisular, lo que puede retrasar o prevenir la curación4. El aumento del daño tisular puede deberse en parte a una mayor actividad de las metaloproteinasas de matriz, colagenasa, elastasa y especies reactivas de oxígeno5. Además, las células inflamatorias y las biopelículas son altos consumidores de oxígeno y, por lo tanto, pueden causar hipoxia tisular local, agotando las células del oxígeno vital necesario para una reparación de tejido efectivo6.
Las biopelículas maduras son altamente resistentes a los agentes antimicrobianos, lo que requiere estrategias agresivas para controlar las infecciones por biopelículas, como el tratamiento mecánico seguido de un tratamiento antimicrobiano efectivo. Debido a que las biopelículas pueden regenerarse rápidamente, los antimicrobianos efectivos pueden reducir el riesgo de reformación después del desbridamiento quirúrgico7.
La plata se usa cada vez más en apósitos antimicrobianos y a menudo se usa como tratamiento de primera línea para heridas infectadas crónicas. Hay muchos aderezos plateados disponibles comercialmente, cada uno que contiene una composición de plata, concentración y matriz base. Los avances en los brazaletes plateados han llevado al desarrollo de nuevos brazaletes plateados. La forma metálica de plata (AG0) es inerte; Para lograr la efectividad antimicrobiana, debe perder un electrón para formar plata iónica (AG1+). Los aderezos plateados tradicionales contienen compuestos de plata o plata metálica que, cuando se exponen al líquido, se descomponen para formar iones Ag1+. Estos iones Ag1+ reaccionan con la célula bacteriana, eliminando electrones de componentes estructurales o procesos críticos necesarios para la supervivencia. La tecnología patentada ha llevado al desarrollo de un nuevo compuesto de plata, AG Oxysalts (Nitrato de plata, AG7NO11), que se incluye en los aderezos para las heridas. A diferencia de la plata tradicional, la descomposición de las sales que contienen oxígeno producen estados de plata con mayor valencia (Ag1+, Ag2+y Ag3+). Los estudios in vitro han demostrado que las bajas concentraciones de sales de plata oxigenadas son más efectivas que la plata iónica única (AG1+) contra las bacterias patógenas como Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Escherichia coli8,9. Otro nuevo tipo de aderezo plateado incluye ingredientes adicionales, a saber, ácido etilendiaminetraacético (EDTA) y cloruro de benzetonio (BC), que se informa que se dirigen a las EP de biopelículas y, por lo tanto, aumentan la penetración de plata en la biopelícula. Estas nuevas tecnologías de plata ofrecen nuevas formas de atacar biopelículas de heridas. Sin embargo, el impacto de estos antimicrobianos en el entorno de la herida y la curación independiente de la infección es importante para garantizar que no creen un ambiente de herida desfavorable o retrasen la curación. Se han informado preocupaciones sobre la citotoxicidad de plata in vitro con varios apósitos plateados11. Sin embargo, la citotoxicidad in vitro aún no se ha traducido en toxicidad in vivo, y varios apósitos AG1+ han demostrado un buen perfil de seguridad12.
Aquí, investigamos la efectividad de los apósitos de carboximetilcelulosa que contienen nuevas formulaciones de plata contra la biopelícula de la herida in vitro e in vivo. Además, se evaluaron los efectos de estos apósitos en las respuestas inmunes y la curación independientemente de la infección.
Todos los aderezos utilizados estaban disponibles comercialmente. El aderezo de fibra de gel Kerracel 3M (3M, Knutsford, Reino Unido) es un aderezo de fibra de gel no antimicrobiano 100% carboximetilcelulosa (CMC) que se usó como aderezo de control en este estudio. Se evaluaron tres apósitos de plata CMC antimicrobianos, a saber, el aderezo Kerracel AG 3M (3M, Knutsford, Reino Unido), que contiene 1.7%en peso. sal de plata oxigenada (AG7NO11) en iones de plata de mayor valencia (Ag1+, Ag2+y Ag3+). Durante la descomposición de AG7NO11, los iones Ag1+, Ag2+ y Ag3+ se forman en una relación de 1: 2: 4. Aquacel AG ASSINEO EXTRA CONTIGUADO 1.2% CLORURO DE PLATA (AG1+) (Convatec, Deeside, Reino Unido) 13 y Aquacel AG+Vestido adicional que contiene 1,2% de cloruro de plata (AG1+), EDTA y cloruro de benzetonio (Convatec, Deeside, Reino Unido) 14.
Las cepas utilizadas en este estudio fueron Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) y Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Las bacterias se cultivaron durante la noche en el caldo Muller-Hinton (Oxoid, Altrincham, Reino Unido). El cultivo nocturno se diluyó luego 1: 100 en el caldo de Mueller-Hinton y 200 µl en placas estériles de 0.2 µM Whatman Cyclopore (Whatman Plc, Maidstone, Reino Unido) en placas de agar Mueller-Hinton (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Gran Bretaña ). ) Formación de biopelícula colonial a 37 ° C durante 24 horas. Estas biopelículas coloniales se probaron para detectar la contracción logarítmica.
Corta el aderezo en piezas cuadradas de 3 cm2 y pre-lago con agua desionizada estéril. Coloque el vendaje sobre la biopelícula de la colonia en la placa de agar. Se eliminaron cada 24 ha de biopelícula, y se cuantificaron bacterias viables dentro de la biopelícula (CFU/ml) mediante dilución en serie (10-1 a 10-7) en el caldo de neutralización del ángulo del día (Merck-Millipore). Después de 24 horas de incubación a 37 ° C, se realizaron recuentos de placas estándar en placas de agar Mueller-Hinton. Cada tratamiento y punto de tiempo se realizó por triplicado, y los recuentos de placas se repitieron para cada dilución.
La piel del vientre de cerdo se obtiene de grandes cerdos blancos femeninos dentro de los 15 minutos posteriores a la matanza de acuerdo con los estándares de exportación de la Unión Europea. La piel se afeitó y se limpió con toallitas de alcohol, luego se congeló a -80 ° C durante 24 horas para devitalizar la piel. Después de descongelar, las piezas de piel de 1 cm2 se lavaron tres veces con PBS, 0,6% de hipoclorito de sodio y etanol al 70% durante 20 minutos cada vez. Antes de eliminar la epidermis, elimine cualquier etanol restante lavando 3 veces en PBS estéril. La piel se cultivó en una placa de 6 pocillos con una membrana de nylon de 0,45 μm de espalda (Merck-Millipore) en la parte superior y 3 almohadillas absorbentes (Merck-Millipore) que contienen 3 ml de suero bovino fetal (Sigma) suplementado con 10% de Dulbecco modificado Águila. Medio (Medio Eagle modificado de Dulbecco - Aldrich Ltd.).
Las biopelículas coloniales se cultivaron como se describe para los estudios de exposición de biopelículas. Después de cultivar la biopelícula en la membrana durante 72 horas, la biopelícula se aplicó a la superficie de la piel usando un bucle de inoculación estéril y se retiró la membrana. Luego, la biopelícula se incubó en la dermis del cerdo durante 24 horas adicionales a 37 ° C para permitir que la biopelícula madure y se adhiera a la piel del cerdo. Después de que la biopelícula había madurado y unido, se aplicó un aderezo de 1,5 cm2, premada con agua destilada estéril, directamente a la superficie de la piel y se incubó a 37 ° C durante 24 horas. Las bacterias viables se visualizaron mediante la tinción aplicando uniformemente el reactivo de viabilidad de células Prestoblue (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Reino Unido) a la superficie apical de cada explante e incubarlo durante 5 minutos. Use la cámara digital Leica DFC425 para capturar instantáneamente imágenes en el microscopio Leica MZ8. Las áreas de color rosa se cuantificaron utilizando Image Pro Software versión 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (Mediacy.com)). La microscopía electrónica de barrido se realizó como se describe a continuación.
Las bacterias cultivadas durante la noche se diluyeron 1: 100 en el caldo de Mueller-Hinton. Se añadieron 200 μl de cultivo a la membrana cicloporo de Whatman de 0,2 μM estéril (Whatman, Maidstone, Reino Unido) y se plataron en agar Mueller-Hinton. Las placas de biopelículas se incubaron a 37 ° C durante 72 horas para permitir la formación de biopelículas maduras.
Después de 3 días de maduración de biopelículas, se colocó un vendaje cuadrado de 3 cm2 directamente en la biopelícula y se incubó a 37 ° C durante 24 horas. Después de eliminar el vendaje de la superficie de la biopelícula, se añadió 1 ml de reactivo de viabilidad de células Prestoblue (Invitrogen, Waltham, MA) a la superficie de cada biopelícula durante 20 segundos. Las superficies se secaron antes de que los cambios de color se grabaron utilizando una cámara digital Nikon D2300 (Nikon UK Ltd., Kingston, Reino Unido).
Prepare cultivos nocturnos en agar Mueller-Hinton, transfiera colonias individuales a 10 ml de caldo Mueller-Hinton e incubate en un agitador a 37 ° C (100 rpm). Después de la incubación durante la noche, el cultivo se diluyó 1: 100 en el caldo de Mueller-Hinton y se detectaron 300 µl en membrana circular de 0.2 µM Whatman Cyclopore (Whatman International, Maidstone, Reino Unido) en Agar de Mueller-Hinton y se incubó a 37 ° C en 72 horas en 72 horas . . La biopelícula madura se aplicó a la herida como se describe a continuación.
Todo el trabajo con animales se llevó a cabo en la Universidad de Manchester bajo una licencia de proyecto aprobada por la Oficina de Bienestar Animal y Revisión Ética (P8721BD27) y de acuerdo con las pautas publicadas por el Ministerio del Interior bajo el ASPA revisado de 2012. Todos los autores se adhirieron a las pautas de llegada. Se usaron ratones C57BL/6J de ocho semanas de edad (Envigo, Oxon, Reino Unido) para todos los estudios in vivo. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Reino Unido) y sus superficies dorsales se afeitaron y limpiaron. Luego, cada mouse recibió una herida de escisión de 2 × 6 mm con un golpe de biopsia de Stiefel (Schuco International, Hertfordshire, Reino Unido). Para las heridas infectadas con biopelícula, aplique la biopelícula colonial de 72 horas cultivadas en la membrana como se describe anteriormente a la capa dérmica de la herida usando un bucle de inoculación estéril inmediatamente después de la lesión y descarte la membrana. Un centímetro cuadrado de aderezo está pre-humedecido con agua estéril para mantener un ambiente de herida húmeda. Los apósitos se aplicaron directamente a cada herida y se cubrieron con una película de Tegaderm 3M (3M, Bracknell, Reino Unido) y el adhesivo líquido de Mastisol (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) aplicado alrededor de los bordes para proporcionar adhesión adicional. La buprenorfina (AnimalCare, York, Reino Unido) se administró a una concentración de 0.1 mg/kg como analgésico. Culle ratones tres días después de la lesión utilizando el método del Anexo 1 y retire, reduzca a la mitad y almacene el área de la herida según sea necesario.
La tinción de hematoxilina (Thermofisher Scientific) y eosina (Thermofisher Scientific) se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. El área de la herida y la reepitelización se cuantificaron utilizando Image Pro Software versión 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Las secciones de tejido se retiraron en xileno (Thermofisher Scientific, Loughborough, Reino Unido), se rehidrataron con etanol graduado del 100-50% y se sumergieron brevemente en agua desionizada (Thermofisher Scientific). La inmunohistoquímica se realizó utilizando el kit Vectastain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los anticuerpos primarios a los neutrófilos NIMP-R14 (ThermoFisher Scientific) y los macrófagos MS CD107B M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, Reino Unido) se diluyeron 1: 100 en solución de bloqueo y se agregaron a la superficie cortada, seguido de 2 anticuerpos anti-, Vectastain El kit de sustrato ABC y Vector Nova Red peroxidasa (HRP) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y contratado con hematoxilina. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio Olympus BX43 y una cámara digital Olympus DP73 (Olympus, Southend-on-Sea, Reino Unido).
Las muestras de piel se fijaron en glutaraldehído al 2,5% y al 4% de formaldehído en HEPES 0,1 M (pH 7,4) durante 24 horas a 4 ° C. Las muestras se deshidrataron usando etanol graduado y se secaron en CO2 usando un secador de punto crítico Quorum K850 (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Reino Unido) y chocó con aleación de oro-paladio de oro utilizando un sistema de descarga de quórum SC7620 Mini Sputter/Glow. Las muestras se tomaron imágenes utilizando un microscopio electrónico de barrido FEI Quanta 250 (ThermoFisher Scientific) para visualizar el punto central de la herida.
Se aplicó yoduro de TOTO-1 (2 μM) a la superficie de la herida de ratón extirpada y se incubó durante 5 minutos a 37 ° C (Thermofisher Scientific) y se trató con SYTO-60 (10 μM) a 37 ° C (Thermofisher Scientific). Se crearon imágenes Z-stack de 15 minutos utilizando un Leica TCS SP8.
Los datos de replicación biológica y técnica se tabularon y analizaron utilizando el software GraphPad Prism V9 (Software GraphPad, La Jolla, CA). El análisis de varianza unidireccional con comparaciones múltiples utilizando la prueba post hoc de Dunnett se utilizó para evaluar las diferencias entre cada tratamiento y el aderezo de control no antimicrobiano. Un valor p <0.05 se consideró significativo.
La efectividad de los apósitos fibrosos en gel plateado se evaluó primero contra colonias de biopelículas de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa in vitro. Los aderezos plateados contienen diferentes fórmulas de plata: los aderezos plateados tradicionales producen iones AG1+; Los apósitos de plata, que pueden producir iones Ag1+ después de la adición de EDTA/BC, pueden destruir la matriz de biopelícula y exponer bacterias a plata bajo el efecto antibacteriano de la plata. iones15 y apósitos que contienen sales oxigenadas que producen iones Ag1+, Ag2+ y Ag3+. Su efectividad se comparó con un aderezo de control no antimicrobiano hecho de fibras gelificadas. Las bacterias viables restantes dentro de la biopelícula se evaluaron cada 24 horas durante 8 días (Figura 1). El día 5, la biopelícula se reinoculó con 3.85 × 105s. Staphylococcus aureus o 1.22 × 105p. Aeruginosa para evaluar la recuperación de biopelículas. En comparación con los apósitos de control no antimicrobianos, los apósitos AG1+ tuvieron un efecto mínimo sobre la viabilidad bacteriana en Staphylococcus aureus y las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa durante 5 días. Por el contrario, los apósitos que contenían sales oxigenadas Ag y Ag1 + + EDTA/BC fueron efectivos para matar bacterias dentro de la biopelícula dentro de los 5 días. Después de la inoculación repetida con bacterias planctónicas en el día 5, no se observó restauración de la biopelícula (Fig. 1).
Cuantificación de bacterias viables en biopelículas de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa después del tratamiento con apósitos de plata. Las colonias de biopelículas de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa se trataron con apósitos plateados o apósitos de control no antimicrobianos, y el número de bacterias viables restantes se determinó cada 24 horas. Después de 5 días, la biopelícula se reinoculó con 3.85 × 105s. Staphylococcus aureus o 1.22 × 105p. Las colonias del bacterioplancton Pseudomonas aeruginosa se formaron individualmente para evaluar la recuperación de biopelículas. Los gráficos muestran la media +/- error estándar.
Para visualizar el efecto de los aderezos plateados en la viabilidad de la biopelícula, se aplicaron apósitos a biopelículas maduras cultivadas en la piel porcina ex vivo. Después de 24 horas, se retira el aderezo y la biopelícula se mancha con un tinte reactivo azul, que se metaboliza por bacterias vivas a un color rosa. Las biopelículas tratadas con apósitos de control fueron rosados, lo que indica la presencia de bacterias viables dentro de la biopelícula (Figura 2A). Por el contrario, la biopelícula tratada con el aderezo AG Oxysols era principalmente azul, lo que indica que las bacterias restantes en la superficie de la piel del cerdo eran bacterias no viables (Figura 2B). Se observó coloración azul y rosa mixta en biopelículas tratadas con apósitos que contienen Ag1+, lo que indica la presencia de bacterias viables y no viables dentro de la biopelícula (Figura 2C), mientras que los apósitos EDTA/BC que contenían Ag1+ eran predominantemente azules con algunos puntos rosados. indicando áreas no afectadas por el aderezo plateado (Figura 2D). La cuantificación de áreas activas (rosas) e inactivas (azul) mostró que el parche de control era 75% activo (Figura 2E). Los apósitos AG1 + + EDTA/BC se desempeñaron de manera similar a los apósitos de sal oxigenados de AG, con tasas de supervivencia del 13% y 14%, respectivamente. El aderezo Ag1+ también redujo la viabilidad bacteriana en un 21%. Estas biopelículas se observaron luego usando microscopía electrónica de barrido (SEM). Después del tratamiento con el aderezo de control y el aderezo Ag1+, se observó una capa de Pseudomonas aeruginosa cubriendo la piel porcina (Figura 2F, H), mientras que después del tratamiento con el aderezo Ag1+, se encontraron pocas células bacterianas y se encontraron pocas células bacterianas debajo. Las fibras de colágeno pueden considerarse como la estructura de tejido de la piel porcina (Figura 2G). Después del tratamiento con aderezo AG1 + + EDTA/BC, fueron visibles placas bacterianas y placas de fibra de colágeno subyacentes (Figura 2i).
Visualización de la biopelícula de Pseudomonas aeruginosa después del tratamiento con aderezo de plata. (A-D) La viabilidad bacteriana en las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa cultivadas en la piel porcina se visualizó utilizando tinte de viabilidad de Prestoblue 24 horas después del tratamiento con apósitos plateados o apósitos de control no antimicrobianos. Las bacterias vivas son rosas, las bacterias no viables y la piel de cerdo son azules. (E) Cuantificación de las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa cultivadas en la piel porcina (mancha rosa) usando microscopía electrónica de barrido Imagen Pro Versión 10 (FI) y tratada con un aderezo plateado o un aderezo de control no antimicrobiano durante 24 horas. Barra de escala SEM = 5 µm. (J - M) Las biopelículas coloniales crecieron en filtros y se tiñeron con tinte reactivo Prestoblue después de 24 h de incubación con apósitos plateados.
Para determinar si el contacto cercano entre los aderezos y las biopelículas afectó la efectividad de los apósitos, las biopelículas coloniales colocadas en una superficie plana se trataron con los aderezos durante 24 horas y luego se mancharon con colorantes reactivos. La biopelícula no tratada era de color rosa oscuro (Figura 2J). A diferencia de las biopelículas tratadas con apósitos que contienen sales de Ag oxigenadas (Figura 2K), las biopelículas tratadas con apósitos que contienen Ag1+ o Ag1++ EDTA/BC mostraron bandas de tinción rosada (Figura 2L, M). Esta coloración rosa indica la presencia de bacterias viables y se asocia con el área de sutura dentro del aderezo. Estas áreas cosidas crean espacios muertos que permiten bacterias dentro de la biopelícula para sobrevivir.
Para evaluar la efectividad de los apósitos plateados in vivo, las heridas extirpadas de ratones infectadas con biopelículas maduras de S. aureus y P. aeruginosa se trataron con apósitos de control no antimicrobianos o apósitos de plata. Después de 3 días de tratamiento, el análisis de imagen macroscópica mostró tamaños de heridas más pequeños cuando se trataba con apósitos de sal oxigenados en comparación con los apósitos de control no antimicrobianos y otros apósitos plateados (Figura 3A-H). Para confirmar estas observaciones, las heridas se cosecharon y el área de la herida y la reepitelización se cuantificaron en secciones de tejido hematoxilina y manchada de eosina utilizando el software Image Pro versión 10 (Figura 3I-L).
El efecto de los apósitos plateados en la superficie de la herida y la reepitelización de las heridas infectadas con biopelículas. (A - h) células pequeñas infectadas con biopelículas de Pseudomonas aeruginosa (A - D) y Staphylococcus aureus (E - H) después de tres días de tratamiento con un aderezo de control no antimicrobiano, un aderezo de sal de Ag oxigenado, un aderezo AG1+ y AG1+ AG1+ vendaje. Imágenes macroscópicas representativas. Heridas de ratones con aderezo AG1 + + EDTA/BC. (IL) Infección representativa de Pseudomonas aeruginosa, secciones histológicas teñidas con hematoxilina y eosina, utilizadas para cuantificar el área de la herida y la regeneración epitelial. Cuantificación del área de la herida (M, O) y la reepitelización porcentual (N, P) de las heridas infectadas con Pseudomonas aeruginosa (M, N) y Staphylococcus aureus (O, P) biopelículas (por grupo de tratamiento N = 12). Los gráficos muestran la media +/- error estándar. * significa p = <0.05 ** significa p = <0.01; Escala macroscópica = 2.5 mm, escala histológica = 500 µm.
La cuantificación del área de la herida en heridas infectadas con la biopelícula de Pseudomonas aeruginosa (Figura 3M) mostró que las heridas tratadas con oxisalts Ag tenían un tamaño de herida promedio de 2.5 mm2, mientras que el apósito de control no antimicrobiano tenía un tamaño de herida promedio de 3.1 mm2, que no es verdadero. alcanzó significación estadística (Figura 3M). p = 0.423). Las heridas tratadas con Ag1+ o Ag1++ EDTA/BC no mostraron reducción en el área de la herida (3.1 mm2 y 3.6 mm2, respectivamente). El tratamiento con aderezo de sal oxigenado de sal promovió la reepitelización en mayor medida que el apósito de control no antimicrobiano (34% y 15%, respectivamente; P = 0.029) y Ag1+ o AG1++ EDTA/BC (10% y 11%) ( Figura 3n). . , respectivamente).
Se observaron tendencias similares en el área de la herida y la regeneración epitelial en heridas infectadas con biopelículas de S. aureus (Figura 3O). Los aderezos que contienen sales de plata oxigenadas reducen el área de la herida (2.0 mm2) en un 23% en comparación con el control no antimicrobiano de control (2.6 mm2), aunque esta reducción no fue significativa (P = 0.304) (Fig. 3O). Además, el área de la herida en el grupo de tratamiento Ag1+ se redujo ligeramente (2.4 mm2), mientras que la herida tratada con aderezo AG1++ EDTA/BC no redujo el área de la herida (2.9 mm2). Las sales de oxígeno de AG también promovieron la reepitelización de las heridas infectadas con la biopelícula de S. aureus (31%) en mayor medida que las tratadas con apósitos de control no antimicrobianos (12%, P = 0.003) (Figura 3p). El aderezo AG1+ (16%, P = 0.903) y el aderezo AG+ 1+ EDTA/BC (14%, P = 0.965) mostraron niveles de regeneración epitelial similares al control.
Para visualizar el efecto de los apósitos plateados en la matriz de biopelículas, se realizó tinción de yoduro de Toto 1 y Syto 60 (Fig. 4). El yoduro de Toto 1 es un colorante impermeable celular que se puede usar para visualizar con precisión los ácidos nucleicos extracelulares, que son abundantes en el EPS de biopelículas. SYTO 60 es un colorante permeable celular utilizado como contratinta16. Observaciones de yoduro de Syto y Syto 60 en heridas inoculadas con biopelículas de Pseudomonas aeruginosa (Figura 4A-D) y Staphylococcus aureus (Figura 4I-L) mostraron que después de 3 días de tratamiento de vestimenta, las EPS en la biofilmas se redujeron significativamente. que contiene sales oxigenadas AG y AG1 + + EDTA/BC. Los apósitos Ag1+ sin componentes de antibiofilm adicionales redujeron significativamente el ADN libre de células en heridas inoculadas con Pseudomonas aeruginosa, pero fueron menos efectivos en las heridas inoculadas con Staphylococcus aureus.
Imágenes in vivo de la biopelícula de la herida después de 3 días de tratamiento con apósitos de control o plata. Imágenes confocales de Pseudomonas aeruginosa (A - D) y Staphylococcus aureus (I - L) teñidas con Toto 1 (verde) para visualizar ácidos nucleicos extracelulares, un componente de polímeros de biofilmes extracelulares. Para manchar los ácidos nucleicos intracelulares, use SYTO 60 (rojo). ácidos. P. Microscopía electrónica de barrido de heridas infectadas con biofilms de Pseudomonas aeruginosa (E - H) y Staphylococcus aureus (M - P) después de 3 días de tratamiento con apósitos de control y plata. Barra de escala SEM = 5 µm. Barra de escala de imagen confocal = 50 µm.
La microscopía electrónica de barrido mostró que los ratones inoculados con colonias de biopelículas de Pseudomonas aeruginosa (Figura 4E-H) y Staphylococcus aureus (Figura 4M-P) tenían significativamente menos bacterias en sus heridas después de 3 días de tratamiento con todos los aderezos de plata.
Para evaluar el efecto de los apósitos de plata sobre la inflamación de la herida en ratones infectados con biopelículas, las secciones de heridas infectadas con biopelículas tratadas con apósitos de control o plata durante 3 días se tiñeron inmunohistoquímicamente usando anticuerpos específicos para neutrófilos y macrófagos. Determinación cuantitativa de neutrófilos y macrófagos internamente. tejido de granulación. Figura 5). Todos los apósitos plateados redujeron el número de neutrófilos y macrófagos en heridas infectadas con Pseudomonas aeruginosa en comparación con los apósitos de control no antimicrobianos después de tres días de tratamiento. Sin embargo, el tratamiento con el aderezo de sal de plata oxigenado dio como resultado una mayor reducción en los neutrófilos (P = <0.0001) y los macrófagos (P = <0.0001) en comparación con otros aderezos plateados probados (Figura 5i, J). Aunque Ag1++ EDTA/BC tuvo un mayor efecto en la biopelícula de la herida, redujo los niveles de neutrófilos y macrófagos en menor medida que el aderezo Ag1+. También se observaron heridas moderadas infectadas con biopelícula de S. aureus después de vestirse con Ag (P = <0.0001), Ag1+ (P = 0.0008) y oxisoles EDTA/BC (P = 0.0043) Ag (P = 0.0043) en comparación con el control. Se observan tendencias similares para la neutropenia. VENDAJE (Fig. 5K). Sin embargo, solo el apósito oxigenado de sal de AG mostró una reducción significativa en el número de macrófagos en el tejido de granulación en comparación con el control en heridas infectadas con biopelículas de S. aureus (P = 0.0339) (Figura 5L).
Los neutrófilos y los macrófagos se cuantificaron en heridas infectadas con biopelículas de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus después de 3 días de tratamiento con control no antimicrobiano o apósitos de plata. Los neutrófilos (AD) y los macrófagos (EH) se cuantificaron en secciones de tejido teñidos con anticuerpos específicos para neutrófilos o macrófagos. Cuantificación de neutrófilos (I y K) y macrófagos (J y L) en heridas infectadas con Pseudomonas aeruginosa (I y J) y Biofilms de Staphylococcus aureus (K&L). N = 12 por grupo. Los gráficos muestran la media +/- Error estándar, valores de significación en comparación con el aderezo de control no antibacteriano, * significa p = <0.05, ** significa p = <0.01; *** significa p = <0.001; indica p = <0.0001).
Luego evaluamos el efecto de los apósitos de plata sobre la curación independiente de la infección. Las heridas escisionales no infectadas se trataron con un aderezo de control no antimicrobiano o un aderezo plateado durante 3 días (Figura 6). Entre los aderezos plateados probados, solo las heridas tratadas con el aderezo de sal oxigenado parecían más pequeñas en imágenes macroscópicas que las heridas tratadas con el control (Figura 6A-D). La cuantificación del área de la herida utilizando el análisis histológico mostró que el área de la herida promedio después del tratamiento con el aderezo AG Oxysols fue de 2.35 mm2 en comparación con 2.96 mm2 para las heridas tratadas con el grupo de control, pero esta diferencia no alcanzó la importancia estadística (P = 0.488) (Fig. . Por el contrario, no se observó reducción en el área de la herida después del tratamiento con los apósitos AG1+ (3.38 mm2, p = 0.757) o AG1++ EDTA/BC (4.18 mm2, P = 0.054) en comparación con el grupo de control. Se observó una mayor regeneración epitelial con el aderezo AG Oxysol en comparación con el grupo de control (30% frente a 22%, respectivamente), aunque esto no alcanzó importancia (p = 0.067), esto es bastante significativo y confirma resultados anteriores. Un aderezo con oxisols promueve la reepitelización. -Epitelización de heridas no infectadas17. En contraste, el tratamiento con los apósitos AG1+ o AG1++ EDTA/BC no tuvo ningún efecto o mostró una disminución de la reepitelización en comparación con el control.
Efecto del aderezo de la herida plateada en la curación de heridas en ratones no infectados con resección completa. (AD) Imágenes macroscópicas representativas de heridas después de tres días de tratamiento con un aderezo de control no antimicrobiano y un aderezo plateado. (EH) Secciones de heridas representativas teñidas con hematoxilina y eosina. La cuantificación del área de la herida (I) y el porcentaje de reepitelización (j) se calcularon a partir de secciones histológicas en el punto medio de la herida utilizando el software de análisis de imágenes (n = 11-12 por grupo de tratamiento). Los gráficos muestran la media +/- error estándar. * significa p = <0.05.
La plata tiene una larga historia de uso como terapia antimicrobiana en la curación de heridas, pero las diferentes formulaciones y métodos de suministro pueden dar lugar a diferencias en la eficacia antimicrobiana 18. Además, las propiedades antibiofilm de sistemas específicos de entrega de plata no se comprenden completamente. Aunque la respuesta inmune del huésped es relativamente efectiva contra las bacterias planctónicas, generalmente es menos efectiva contra las biopelículas19. Las bacterias planctónicas se fagocitan fácilmente por los macrófagos, pero dentro de las biopelículas, las células agregadas plantean problemas adicionales al limitar la respuesta del huésped en la medida en que las células inmunes pueden sufrir apoptosis y liberar factores proinflamatorios para mejorar la respuesta inmune20. Se ha observado que algunos leucocitos pueden penetrar en biopelículas21, pero no pueden fagocitar bacterias una vez que esta defensa se ve comprometida22. Se debe utilizar un enfoque holístico para apoyar la respuesta inmune del huésped contra la infección por biopelículas de la herida. El desbridamiento de las heridas puede interrumpir físicamente la biopelícula y eliminar la mayor parte de la biovultia, pero la respuesta inmune del huésped puede ser ineficaz contra la biopelícula restante, especialmente si la respuesta inmune del huésped se ve comprometida. Por lo tanto, las terapias antimicrobianas como los apósitos plateados pueden soportar la respuesta inmune del huésped y eliminar las infecciones de biopelículas. La composición, concentración, solubilidad y sustrato de entrega puede influir en la efectividad antimicrobiana de la plata. En los últimos años, los avances en la tecnología de procesamiento de plata han hecho que estos apósitos sean más efectivos 9,23. A medida que avanza la tecnología de vestimenta plateada, es importante comprender la efectividad de estos apósitos para controlar la infección por heridas y, lo que es más importante, el impacto de estas potentes formas de plata en el entorno de la herida y la curación.
En este estudio, comparamos la efectividad de dos apósitos de plata avanzados con apósitos de plata convencionales que producen iones Ag1+ contra biopelículas utilizando diferentes modelos in vitro e in vivo. También evaluamos el efecto de estos apósitos en el entorno de la herida y la curación independiente de la infección. Para minimizar la influencia de la matriz de entrega, todos los apósitos plateados probados estaban compuestos de carboximetilcelulosa.
Nuestra evaluación preliminar de estos apósitos plateados contra biopelículas coloniales de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus muestra que, a diferencia de los apósitos de AG1+ tradicionales, dos apósitos de plata avanzados, AG1++ EDTA/BC y sales de Ag oxigenadas, son efectivas a 5. algunos días. Además, estos aderezos evitan la reformación de la biopelícula tras la exposición repetida a bacterias planctónicas. El aderezo Ag1+ contenía cloruro de plata, el mismo compuesto de plata y matriz base que Ag1++ EDTA/BC, y tuvo un efecto limitado sobre la viabilidad bacteriana dentro de la biopelícula durante el mismo período. La observación de que un aderezo AG1++ EDTA/BC fue más efectiva contra la biopelícula que un aderezo AG1+ que consiste en la misma matriz y un compuesto de plata respalda la noción de que se requieren ingredientes adicionales para aumentar la efectividad del cloruro de plata contra la biopelícula, como se ha informado. en otro lugar15. Estos resultados respaldan la idea de que BC y EDTA juegan un papel adicional que contribuye a la efectividad general del aderezo y que la ausencia de este componente en los apósitos AG1+ puede haber contribuido a la falta de manifestación in vitro. Descubrimos que los apósitos de sal de Ag oxigenados que producen iones Ag2+ y Ag3+ exhibieron una eficacia antibacteriana más fuerte que Ag1+ y en niveles similares a Ag1++ EDTA/BC. Sin embargo, debido al alto potencial redox, no está claro cuánto tiempo permanecen activos y efectivos contra las biopelículas de heridas y, por lo tanto, merecen más estudios. Además, hay muchos apósitos diferentes que generan iones Ag1+ que no se probaron en este estudio. Estos apósitos están compuestos de diferentes compuestos de plata, concentraciones y matrices base, lo que puede influir en la entrega de iones Ag1+ y su efectividad contra las biopelículas. También vale la pena señalar que hay muchos modelos in vitro e in vivo diferentes utilizados para evaluar la efectividad de los aderezos para las heridas contra las biopelículas. El tipo de modelo utilizado, así como el contenido de sal y proteína de los medios utilizados en estos modelos, influirá en la efectividad del aderezo. En nuestro modelo in vivo, permitimos que la biopelícula madure in vitro y luego la transfiriera a la superficie dérmica de la herida. La respuesta inmune del ratón huésped es relativamente efectiva contra las bacterias planctónicas aplicadas a la herida, formando así una biopelícula a medida que la herida cura. La adición de biopelícula madura a una herida limita la efectividad de la respuesta inmune del huésped a la formación de biopelículas al permitir que la biopelícula madura se establezca dentro de la herida antes de que pueda comenzar la curación. Por lo tanto, nuestro modelo nos permite evaluar la efectividad de los apósitos antimicrobianos en biopelículas maduras antes de que las heridas comiencen a sanar.
También descubrimos que el ajuste de aderezo influyó en la efectividad de los apósitos de plata en biopelículas cultivadas in vitro y piel porcina. El contacto cercano con la herida se considera crítico para la efectividad antimicrobiana del aderezo24,25. Los apósitos que contenían sales de Ag oxigenadas estaban en contacto cercano con biopelículas maduras, lo que resultó en una reducción significativa en el número de bacterias viables dentro de la biopelícula después de 24 horas. Por el contrario, cuando se tratan con apósitos AG1+ y Ag1++ EDTA/BC, quedaron un número significativo de bacterias viables. Estos aderezos contienen suturas a lo largo de toda la longitud del aderezo, lo que crea espacios muertos que impiden un contacto cercano con la biopelícula. En nuestros estudios in vitro, estas áreas sin contacto impidieron el asesinato de bacterias viables dentro de la biopelícula. Evaluamos la viabilidad bacteriana solo después de 24 horas de tratamiento; Con el tiempo, a medida que el aderezo se sature más, puede haber menos espacio muerto, reduciendo el área para estas bacterias viables. Sin embargo, esto resalta la importancia de la composición del aderezo, no solo el tipo de plata en el aderezo.
Si bien los estudios in vitro son útiles para comparar la efectividad de las diferentes tecnologías de plata, también es importante comprender los efectos de estos apósitos en las biopelículas in vivo, donde las respuestas del tejido huésped y las respuestas inmunes contribuyen a la efectividad de los aderezos contra las biopelículas. El efecto de estos apósitos en las biopelículas de la herida se observó usando microscopía electrónica de barrido y tinción con EPS de la biopelícula utilizando tintes de ADN intracelular y extracelular. Descubrimos que después de 3 días de tratamiento, todos los aderezos fueron efectivos para reducir el ADN libre de células en heridas infectadas con biopelículas, pero el aderezo Ag1+ fue menos efectivo en las heridas infectadas con Staphylococcus aureus. La microscopía electrónica de barrido también mostró que estaban presentes significativamente menos bacterias en las heridas tratadas con los aderezos plateados, aunque esto fue más pronunciado con el aderezo de sal oxigenado y el aderezo AG1++ EDTA/BC en comparación con el aderezo AG1+. Estos datos muestran que los apósitos plateados probados tenían diversos grados de impacto en la estructura de biopelículas, pero ninguno de los apósitos plateados pudo erradicar la biopelícula, lo que respalda la necesidad de un enfoque holístico para el tratamiento de infecciones por biopelículas de heridas; Uso de brazaletes plateados. El tratamiento está precedido por el desbridamiento físico para eliminar la mayor parte de la biopelícula.
Las heridas crónicas a menudo se encuentran en un estado de inflamación severa, con un exceso de células inflamatorias restantes en el tejido de la herida durante un período prolongado de tiempo, causando daño tisular y agotando el oxígeno necesario para un metabolismo celular eficiente y funcionan en la herida26. Las biopelículas exacerban este entorno de herida hostil al afectar negativamente la curación de varias maneras, incluida la inhibición de la proliferación y la migración celular y la activación de las citocinas proinflamatorias27. A medida que los apósitos de plata se vuelven más efectivos, es importante comprender el impacto que tienen en el entorno de la herida y la curación.
Curiosamente, aunque todos los apósitos plateados afectaron la composición de biopelículas, solo los apósitos de sal de plata oxigenados aumentaron la reepitelización de estas heridas infectadas. Estos datos respaldan nuestros hallazgos anteriores17 y los de Kalan et al. (2017) 28, que demostró buenos perfiles de seguridad y toxicidad de sales de plata oxigenadas, ya que las concentraciones más bajas de plata eran efectivas contra las biopelículas.
Nuestro estudio actual destaca las diferencias en la tecnología de plata entre los apósitos de plata antimicrobianos y el impacto de esta tecnología en el entorno de la herida y la curación independiente de la infección. Sin embargo, estos resultados difieren de estudios previos que muestran que el aderezo AG1 + + EDTA/BC mejoró los parámetros de curación de las orejas de conejo lesionadas in vivo. Sin embargo, esto puede deberse a diferencias en modelos animales, tiempos de medición y métodos de aplicación bacteriana29. En este caso, las mediciones de heridas se tomaron 12 días después de la lesión para permitir que los ingredientes activos del aderezo actúen sobre la biopelícula durante un período de tiempo más largo. Esto está respaldado por un estudio que mostró que las úlceras de las piernas clínicamente infectadas tratadas con Ag1 + + EDTA/BC aumentaron inicialmente de tamaño después de una semana de tratamiento, y luego durante las siguientes 3 semanas de tratamiento con AG1 + + EDTA/BC y dentro de las 4 semanas de después Uso de no antimicrobianos. drogas. Adertos de CMC para reducir el tamaño de las úlceras30.
Previamente se ha demostrado que ciertas formas y concentraciones de plata son citotóxicas in vitro 11, pero estos resultados in vitro no siempre se traducen en efectos adversos in vivo. Además, los avances en tecnología plateada y una mejor comprensión de los compuestos de plata y las concentraciones en los apósitos han llevado al desarrollo de muchos apósitos plateados seguros y efectivos. Sin embargo, a medida que avanza la tecnología de vestimenta plateada, es importante comprender el impacto de estos apósitos en el entorno de la herida31,32,33. Anteriormente se informó que la mayor tasa de reepitelización corresponde a una mayor proporción de macrófagos M2 antiinflamatorios en comparación con el fenotipo M1 proinflamatorio. Esto se observó en un modelo de ratón anterior donde se compararon los aderezos para la herida de hidrogel plateado con sulfadiazina plateada e hidrogeles no antimicrobianos34.
Las heridas crónicas pueden exhibir una inflamación excesiva y se ha observado que la presencia de exceso de neutrófilos puede ser perjudicial para la curación de la herida35. En un estudio en ratones con agotamiento de neutrófilos, la presencia de neutrófilos retrasó la reepitelización. La presencia de exceso de neutrófilos conduce a altos niveles de proteasas y especies reactivas de oxígeno, como el superóxido y el peróxido de hidrógeno, que están asociados con heridas crónicas y de curación lenta 37,38. Del mismo modo, un aumento en los números de macrófagos, si no está controlado, puede conducir a una retraso en la curación de la herida39. Este aumento es particularmente importante si los macrófagos no pueden hacer la transición de un fenotipo proinflamatorio a un fenotipo pro-curado, lo que resulta en que las heridas no salen de la fase inflamatoria de la curación40. Observamos una disminución en los neutrófilos y los macrófagos en heridas infectadas con biopelículas después de 3 días de tratamiento con todos los apósitos de plata, pero la disminución fue más pronunciada con los apósitos de sal oxigenados. Esta disminución puede ser un resultado directo de la respuesta inmune a la plata, una respuesta a la disminución de la biovurden o la herida en una etapa posterior de curación y, por lo tanto, se reducen las células inmunes en la herida. Reducir el número de células inflamatorias en la herida puede mantener un entorno propicio para la curación de la herida. El mecanismo de acción de cómo las oxisaltas AG promueven la curación independiente de la infección no está claro, pero la capacidad de las oxisaltas de Ag para producir oxígeno y destruir los niveles dañinos de peróxido de hidrógeno, un mediador de la inflamación, puede explicar esto y requiere más estudio17.
Las heridas infectadas crónicas no curadas plantean un problema tanto para los médicos como para los pacientes. Aunque muchos apósitos afirman la efectividad antimicrobiana, la investigación rara vez se centra en otros factores clave que influyen en el microambiente de la herida. Este estudio muestra que diferentes tecnologías de plata tienen diferentes eficacia antimicrobiana y, lo que es más importante, diferentes efectos en el entorno y la curación de la herida, independientemente de la infección. Aunque estos estudios in vitro e in vivo muestran la efectividad de estos apósitos en el tratamiento de infecciones de heridas y promoviendo la curación, se necesitan ensayos controlados aleatorios para evaluar la efectividad de estos apósitos en la clínica.
Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente con solicitud razonable.
Tiempo de publicación: julio-15-2024